减蛋综合征病毒（EDSV）pVⅢ蛋白基因的克隆与分析

减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ｐＶⅢ蛋白基因的克隆与分析李茂祥＊金奇章金钢＊李虹曾力宇殷震＊侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室，北京１０００００）减蛋综合征病毒（ｅｇｇｄｒｏｐｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）是Ⅲ群禽腺...     

减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆和表达

根据Genebank中EDSV-AV127的序列设计一对引物，从EDSV四川株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到pUC18中，PCR、限制性内切酶分析和序列分析表明：所扩增、克隆的基因片段包括了EDSV六邻体蛋白基因的完整序列。将克隆的基因正向插入pBV220的PRPL启动子游的SmaⅠ位点，经SDS-PAGE、Western印迹和琼脂扩散试验表明：六邻体蛋白基因在大肠杆菌中获得了表达并具有免疫学活性。     

减蛋综合征病毒(EDSV)的分离与鉴定

从河北邯郸某鸡场190d未经EDS疫苗免疫的，突然产蛋下降并出现大量软壳蛋，无壳蛋的鸡群中分离到一株病毒，经理化特性鉴定，单抗Dot-ELISA检测，DNA探针斑点杂交，确定分离到的病毒为EDSV。经限制性核酸内切酶酶切分析，表明分离株EDSV标准株AV127属于同一个基因型。     

减蛋综合征病毒pVⅢ基因和E3区序列测定及结构分析

克隆了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）中国分离株基因组ＨｉｎｄⅢ－Ｅ片段,并分析了其核苷酸序列。该片段位于基因组中央５８．７～６８．９物理图谱单位（ｍｕ）,片段全长共３１９４ｂｐ。其中含有１个完整的和２个不完整的开放性读码框架（ＯＲＦ）,分别编码ｐＶⅢ蛋白、１００Ｋ蛋白基因Ｃ端和纤维蛋白Ｎ末端部分。ｐＶⅢ蛋白基因由７５３个碱基（ｎｔ）组成,编码２５０个氨基酸（ａａ）,编码产物的分子量为２８５００。氨基酸水平的同源性比较表明,ＥＤＳＶ的ｐＶⅢ蛋白与禽腺病毒１型（ＦＡＶ１）及人和其他动物腺病毒ｐＶⅢ蛋白的同源性为２８％～３６％,而与羊腺病毒（ＯＡＶ）的同源性高达５２％,提示ＥＤＳＶ与ＯＡＶ间的亲缘关系更近。按照人腺病毒基因组结构的特征,在ｐＶⅢ和纤维蛋白基因之间,应为Ｅ３区,但该序列只有２４５个ｎｔ组成,序列中保留了ＴＡＴＡＢｏｘ和ｐｏｌｙＡ信号。但除了２个仅编码４９ａａ和３２ａａ多肽的ＯＲＦｓ外,不编码任何产物,且核苷酸序列与其他腺病毒的Ｅ３区无同源性,证实此区无明显Ｅ３区样结构。     

鸡减蛋综合征病毒的分离和初步鉴定

河北省秦皇岛旧１９９８年１０月至１９９９年３月间３０多个鸡场约２７万只鸡发生一起以产蛋率下降３０％以上,同时伴有软壳蛋、退色蛋的疾病,病程１．５￣２个月。采取输卵管、脾脏和肛拭粪样接种于鸭胚,分离到具有血凝性的病毒,用抗ＥＤＳ－７６Ｖ阳性血清与分离毒做ＨＩ试验,结果分离毒的血凝性可被抗ＥＤＳ－７６Ｖ的阳性血清所抑制。因此初步认为秦皇岛市也有ＥＤＳ－７６的发生。     

鸡减蛋综合征病毒的分离与鉴定

从产蛋率下降和出现软壳蛋、薄壳蛋、破壳蛋、无壳蛋等畸形蛋的养鸡厂采集病料,接种于9日龄的鸭胚尿囊腔后分离到1株病毒,经过流行病学调查、细菌分离试验、血凝试验、血凝抑制试验和分离病毒对健康蛋鸡的致病性研究,将分离病毒鉴定为鸡减蛋综合征病毒.     

产蛋下降综合征病毒的分离鉴定

对我省几个暴发产蛋下降综合征的鸡群进行了流行病学调查。用９日龄的鸭胚从病鸡的输卵管和子宫内分泌到两株ＥＤＳ－７６病毒。该病毒对鸡红细胞的凝集作用可被ＥＤＳ－７６的标准阳性血清所抑制。用分离毒接种１８９日龄产蛋母鸡６只，６／６发病。接毒后５天，可从血中测出ＨＩ抗体，１５天时达最高峰，２５天后开始渐渐下降。卵黄ＨＩ抗体与血液ＨＩ抗体呈正相关，只是卵黄ＨＩ抗体价比血液的高一个滴度。接毒鸡所产的蛋，ＥＤＳ     

减蛋综合征病毒的分子生物学

减蛋综合征病毒具有典型的腺病毒形态结构,其基因组长33.2kb,分子量为22.6×106Da,各地分离株间有变异。以DNA复制为界,EDSV基因组分为早期E区(包括Eib、E2a、E2b、E3和E4区)和晚期L区(L1－L5区),早期区编码病毒复制所必需的酶类;晚期区编码五邻体、六邻体等主要结构蛋白,以及DNA结合蛋白、末端前体蛋白等病毒包装蛋白。EDSV分子生物学的深入研究为建立本病的诊断与防制技术,开发理想的表达载体系统,及确定其在病毒学中的分类地位奠定了基础。     

鸡减蛋综合征病毒DNA结合蛋白的基因结构及同源分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２株，经常规方法提取其病毒核酸后，构建了限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库。对其中ＨｉｎｄⅢ－Ｆ片段（５２．９～５８．９ｍｕ）的正反２条链的序列测定发现，其反链存在１个编码容量为３８７个氨基酸（ａａ）的开放读码框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），经Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬ同源搜寻后证实其编码产物为ＥＤＳＶ的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）。与其他腺病毒ＤＢＰ的氨基酸序列进行同源比较，其Ｎ端同源性在１９．０％～４６．２％之间，Ｃ端同源性在２７．７％～６０．４％之间。腺病毒ＤＢＰ的３个保守序列ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３在ＥＤＳＶＤＢＰ中有较大变化，但ＥＤＳＶＤＢＰ的锌指框架（Ｚｎ２＋ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ）却保留了对其功能必需的残基。     

光生物素标记六邻体蛋白基因探针检测减蛋综合征病毒的研究

根据基因文库中减蛋综合征病毒（EDSV）AV127株的序列设计1对引物，从四川本地分离的EDSVSG9301株中扩增出六邻体蛋白基因并将其克隆到PUC18的多克隆位点中，经PCR、酶切分析、DNA杂交分析和序列测定证明，所扩增、克隆的基因包括了六邻体蛋白基因从起始密码子到终止密码子在内的完整序列。用光生物素对含六邻体蛋白基因的重组质粒标记后，采用斑点印迹法对4株EDSV（标准株AV-127株和3株四川分离株）、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒的核酸进行检测，结果，该探针能检测出4株EDSV，但不能检出新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸭瘟病毒。表明该六邻体蛋白基因探针具有特异性，检测的灵敏度高达1pg。     

减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究

从ＧｅｎｅＢａｎｋ的１段含六邻体蛋白基因、蛋白酶基因、ＤＮＡ结合蛋白基因的序列中,应用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计了２对引物。用这２对引物在分别对反应体系成分和聚合酶链反应（ＰＣＲ）试验条件进行优化后,成功地建立了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）套式ＰＣＲ检测技术。对鹌鹑源ＥＤＳＶＱＡＶｃ－９４株、ＡＶ－ｘｂ西北分离株、ＡＶ－１２７国际标准株扩增结果,第一轮ＰＣＲ得到约２９０ｂｐ的特异性片段,第二轮ＰＣＲ得到约９０ｂｐ的片段,与预期２８９ｂｐ、８９ｂｐ的设计相符合。而传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）疫苗株Ｂ８７、鸡亲城疫病毒（ＮＤＶ）Ⅳ系疫苗株（ＬａＳｏｔａ）和正常尿囊液等对照的扩增结果均未显示任何扩增条带,有很好的特异性。所建立的套式ＰＣＲ检测方法具有特异、快速的优点,其灵敏度比常规ＰＣＲ灵敏１００倍,可检测出０．０１ｆｇ的     

鸡减蛋综合征病毒的理化特性鉴定

利用电镜技术、细胞培养技术及琼脂糖凝胶电泳技术鉴定了鸡减蛋综合征病毒EDSVHS - 1株的理化特性 ,该病毒形态为球形 ,直径为 70～ 80纳米 ,无囊膜 ,对氯仿 ,乙醚不敏感 ,耐酸 ,病毒核酸类型是DNA ,不分节段 ,分子长度测定为 33.6× 10 3 个碱基。     

减蛋综合征病毒基因组HindⅢ酶切片段的克隆及酶谱分析

以ＰＵＣ１９质粒为载体,采用鸟枪法克隆减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）基因组的ＨｉｎｄⅢ酶切片段,用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ｄＵＴＰ标记的ＥＤＳＶＨｉｎｇⅢ片段探针打点杂交,证实１３个克隆插入了ＥＤＳＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢ片段。酶切分析结果表明,克隆到了Ａ、Ｂ、Ｆ、ＧＨ、Ｉ、Ｊ７个不同大小的片段,选取上述插入片段的、具有代表性的７个相应质粒ＰＵＨＡ、ＰＵＨＢ、ＰＵＨＦ、ＰＵＨＧ、ＰＵＨＨ、ＰＵＨＩ、ＰＵＨ     

应用降落PCR检测减蛋综合征病毒的研究

根据已发表的减蛋综合征病毒(EDSV)核苷酸序列设计了1对扩增长度为1．1kb左右的引物，采取降落PCR对EDSV-gDNA进行扩增。结果，从2份EDSV鸭胚尿囊液、3份人工感染鸡输卵管组织液的核酸抽提物中，均扩增出与设计大小完全一致的目的片段，而对照样品的扩增均为阴性，该方法最低可检测到32Pg的EDSV-gDNA。表明该降落PCR用于检测EDSV特异性和敏感性均较强，可用于减蛋综合征的诊断。     

减蛋综合征病毒末端片段的克隆及细胞内DNA重组

采用９～１０日龄非免疫鸭胚增殖的减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２毒株,经差速离心法浓缩纯化后,提取病毒基因组ＤＮＡ。采用碱变性法除去病毒基因组共价结合的末端蛋白（ＴＰ）。用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ水解纯化的ＥＤＳＶ基因组ＤＮＡ。经低熔点琼脂糖凝胶电泳后,回收Ｃ、Ｄ、Ｅ片段。克隆到ｐＵＣ１９载体的ＨｉｎｄⅢ和ＳｍａⅠ双酶切位点及ＨｉｎｄⅢ位点上,经蓝白斑筛选和单、双酶切鉴定,获得了ｐＵＨＣ、ｐＵＨＤ、ｐＵＨＥ重组质粒,其中ｐＵＨＣ含有末端片段。将ＥＤＳＶＳａｌⅠ水解产生并回收的大片段与ｐＵＨＣ在９５℃水浴中变性,６５℃复性后,用钙离子介导法,共转染５０％～７０％的单层鸭胚成纤维细胞,转染后３６ｈ开始产生细胞病变（ＣＰＥ）。４８ｈ后将病变细胞反复冻融,经尿囊腔接种９～１０日龄鸭胚,回收的尿囊液能凝集鸡红细胞,这种血凝性能被ＥＤＳＶ高免血清抑制,电镜下观察到腺病毒样颗粒。