黄鳝血清、肠黏液免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

采用硫酸铵盐析、SephadexG-200凝胶层析等方法从黄鳝血清和肠道黏液中分离纯化出黄鳝血清和黄鳝肠黏液免疫球蛋白。SDS—PAGE分析表明,二者的理化性质相同;经β-巯基乙醇处理后解离形成重链和轻链两个亚单位,分子量分别为74kD和29kD。试验结果表明,黄鳝血清和肠黏液中存在免疫球蛋白,二者具有相同的层析和SDS-PAGE电泳特性。     

马氏珠母贝黏液糖蛋白分离纯化及其抗氧化活性研究

该研究采用直接醇沉法、盐提醇沉法和水提醇沉法提取马氏珠母贝(Pinctada martensii)黏液中的糖蛋白,优选直接醇沉法粗品(DAS),进一步采用Sephacryl S-200纯化获得直接醇沉纯化品(DAPS),同时测定DAS及DAPS的体外抗氧化活性。结果显示,DAS的糖和蛋白质得率均最高,且3种方法提取的糖蛋白粗品蛋白质组成无明显差异;DAPS的总糖和蛋白质质量分数分别为(22.72±0.26)%和(71.18±0.62)%,分子量主要集中在245kD;DAS和DAPS对羟自由基的清除能力显著,在0.8 mg·mL-1下两者对羟自由基的清除率均高于90%,对超氧阴离子自由基及DPPH自由基也有一定清除能力。研究结果可为探索马氏珠母贝黏液功效组分提供理论基础数据。     

鳜皮肤黏液IgM样蛋白的纯化

对经嗜水气单胞菌全菌疫苗浸泡免疫后的鳜皮肤黏液中的免疫球蛋白采用盐析法、重组蛋白A(HiTrap rProteinA Sepharose)亲和层析法及鼠抗鳜血清IgM单克隆抗体偶联的Sepharose 4B亲和层析法分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较。结果表明:50%硫酸铵溶液可以沉淀黏液中大部分蛋白,条带仍较多,约十几条,其中含有72 ku和29 ku的条带,因此仅可作为免疫球蛋白粗提的方法;Sepharose 4B亲和层析法所提取鳜黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72 ku和29 ku 2个条带(初步认为鳜黏液Ig的重链和轻链),与鳜血清IgM的重、轻链分子量相同;rProteinA亲和层析法所提蛋白除具有上述重链(72 ku)和轻链(29 ku)外,还含有43 ku的蛋白带(可能为鳜黏液Ig另外一种形式的重链)。Western-blot显示,兔抗鳜Ig多克隆抗体可与72 ku及43 ku条带发生发应。两种亲和法所提蛋白纯度较高,但含量较低,条带较淡,仅可作为实验室小量提纯鳜黏液Ig的有效方法。     

牙鲆皮肤黏液免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸铵分步盐析结合Sephacryl S-300凝胶过滤层析及DEAE Sepharose离子层析法,对牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig)进行了分离纯化,并通过SDS-PAGE及Western-blotting技术对纯化蛋白的部分特性进行了分析。结果表明,30%、50%饱和硫酸铵分步盐析可以去除牙鲆黏液中除Ig外的很多杂蛋白,得到粗提黏液Ig;再经Sephacryl S-300纯化,Ig纯度较高,其中含有72和26 ku的条带;DEAE Sepharose层析法可进一步纯化Sephacryl S-300柱层析的产物,所提取黏液Ig经SDS-PAGE检测,只含有72和26 ku两个条带,初步认为是牙鲆黏液Ig的重链和轻链。Western-blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig单克隆抗体可与黏液Ig重链72 ku条带发生发应。     

黄鳝肠道蛋白酶的分离纯化及其性质

黄鳝(MonopterusalbusZuiew)肠道经组织捣碎,正丁醇脱脂,硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose离子交换层析和SephacrylS 200凝胶过滤,得到蛋白酶纯品。经等电聚焦电泳和SDS PAGE均显示为单一条带。酶的等电点为6 2,最适温度为55℃,最适pH值为10 5,Km(酪蛋白)值为5 5×103mg/L。用SDS PAGE和SephacrylS 200测得其分子量分别为26kD和25 5kD。酶的pH稳定性较好,在pH12时室温保持5h,活力还剩55%。NBS、BrAc、TNBS、PMSF对酶有很强的抑制作用,而PCMB、ME对酶活性影响不大。Ca2+对酶活性无激活作用,Mg2+和K+对酶活性有轻微抑制作用,EDTA对酶活性有很强的抑制作用,Na+对酶活性无影响。     

黄鳝肝脏碱性磷酸酶的分离纯化及部分动力学性质研究

经Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)抽提,正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀分离,DEAE-琼脂糖离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛纯化,从黄鳝肝脏组织中获得单一电泳纯碱性磷酸酶制剂.该酶提纯倍数为123.12倍,比活力2957.34 U/mg.酶学性质和动力学性质研究表明,该酶在260 nm处有一特征吸收峰,等电点为5.21;该酶催化磷酸苯二钠水解反应,初速度为6.02 μmol/(L·min),米氏常数为1.17 mmol/L,最大反应速度为13.75 μmol/(L·min),反应活化能为52.6 kJ·mol;最适pH为10.4,pH＞11不稳定;最适温度为40℃,温度高于50℃不稳定.     

大弹涂鱼皮肤黏液的抑菌活性和蛋白质组学

皮肤黏液是鱼类免疫防御的第一道防线。大弹涂鱼皮肤黏液对其免疫防御、渗透压维持以及适应水陆生活等方面具有重要意义。为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的蛋白质分子组成,对其皮肤黏液开展了抑菌活性分析和蛋白质组学分析。通过电刺激法收集大弹涂鱼皮肤黏液,采用打孔法比较了皮肤黏液和血清的抑菌活性差异;进一步利用鳗弧菌对大弹涂鱼进行诱导,采用生长曲线抑制法分析和比较了诱导前后皮肤黏液的抑菌活性差异。利用Shotgun质谱技术,结合大弹涂鱼皮肤转录组数据库,对大弹涂鱼皮肤黏液开展了蛋白质组学分析;进一步利用String软件对所鉴定的蛋白质开展了蛋白质相互作用预测。大弹涂鱼皮肤黏液具有广谱抑菌活性,鳗弧菌诱导后的大弹涂鱼皮肤黏液与诱导前相比,对部分革兰氏阴性菌的抑菌活性明显上升,但对其他菌株的抑菌活性差异不明显。从大弹涂鱼皮肤黏液中共鉴定各类蛋白质分子97种,基本分子组成与其他硬骨鱼类皮肤黏液蛋白相似,但也有少数蛋白如泛素蛋白、胸腺素蛋白等未在其他鱼类皮肤黏液中报道。此外,其他鱼类中所鉴定到的部分蛋白如热休克蛋白、抗菌肽等在大弹涂鱼皮肤黏液中未能鉴定到。大弹涂鱼皮肤黏液中已鉴定的蛋白多数具有与免疫功能相关的结构域,且存在一个以肌动蛋白为核心的相互作用网络。大弹涂鱼皮肤黏液具有明显的广谱抑菌活性,其蛋白质组成与其他鱼类皮肤黏液具有一定的相似性。本研究为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的分子多样性及功能机制奠定了基础。     

抗菌肽对黄鳝生长性能及免疫力的影响

在水温27.5℃～31.2℃下,将平均体质量（30±5）g的黄鳝（Monopterus albus）饲养在长2 m×宽2 m的网箱中,分别投喂基础饲料（对照组）和添加抗菌肽200 mg/kg（组Ⅰ）、400 mg/kg（组Ⅱ）、600 mg/kg（组Ⅲ）和800mg/kg（组Ⅳ）的试验饲料。68 d后,测定黄鳝的生长及免疫相关指标及嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）攻毒后各组黄鳝的成活率和免疫保护力,研究饲料中添加抗菌肽对黄鳝生长性能及免疫力的影响。结果显示：饲料中添加抗菌肽黄鳝的相对增重率比对照组高8.9%～33.0%,饵料系数降低3.1%～16.2%,成活率高3.1%～7.2%;血清总蛋白（TP）含量显著增加（P<0.05）,酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性显著提高（P<0.05）,添加量为800 mg/kg时AKP活性最大,比对照组增加37.6%。添加量为600 mg/kg时ACP、SOD、GSH-Px和CAT活性最大,分别比对照组增加了63.3%、...     

海蜇毒素的分离纯化及其性质的初步研究

通过研究冻融海蜇触手,Sephadex G-10凝胶过滤层析脱盐,SP Sephadex C-25离子交换层析等分离纯化技术,从海蜇Rhopilema esculentum触手中分离到RE-5-6毒素,初步测定其分子量约为66.2 kD并对其性质进行了初步研究.结果表明,RE-5-6具有下列性质.(1)对鸡血表现出较强的溶血活性;(2)可大大提高小白鼠的对热痛阈值即有明显的镇痛效果,且镇痛作用随着注射浓度的增加而加强;(3)对小白鼠皮肤和眼睛分别表现中度和轻度刺激性;(4)对革蓝氏阴性菌大肠杆菌以及真菌白色念珠菌等有抑制作用.但未检测到丝氨酸蛋白酶抑制剂活性.     

牙鲆不同组织抗菌肽的提取及部分性质检测

以新鲜的牙鲆为试验材料,用100%丙酮和90%甲醇配制的提取液,从牙鲆的鳃、皮肤、肝、肾组织中提取抗菌肽,并对牙鲆抗菌肽粗提物进行部分性质检测。抑菌试验证明,牙鲆各组织提取物对大肠杆菌、鳗弧菌有较强的抑制作用,并且不同组织的抑制作用有所差别,而对金黄色葡萄球菌的抑制效果不明显。提取物经过加热处理后,抑菌圈略有变小。相反,经过胰蛋白酶处理后,抑菌圈略有变大。牙鲆的多种组织中含有对细菌有抑制作用的抗菌肽。     

Isolation of heat-tolerant myoglobin from Asian swamp eel Monopterus albus

Myoglobin from Asian swamp eel Monopterus albus was purified from fish muscle using salt fractionation followed by column chromatography and molecular filtration. The purified Mb of 0.68?mg/g wet weight of muscle was determined for its molecular mass by MALDI-TOF-MS to be 15,525.18?Da. Using isoelectric focusing technique, the purified Mb showed two derivatives with pI of 6.40 and 7.12. Six peptide fragments of this protein identified by LC-MS/MS were homologous to Mbs of sea raven Hemitripterus americanus, yellowfin tuna Thunnus albacores, blue marlin Makaira nigicans, common carp Cyprinus carpio, and goldfish Carassius auratus. According to the Mb denaturation, the swamp eel Mb had thermal stability higher than walking catfish Clarias batrachus Mb and striped catfish Pangasius hypophthalmus Mb, between 30 and 60?(°)C. For the thermal stability of Mb, the swamp eel Mb showed a biphasic behavior due to the O(2) dissociation and the heme orientation disorder, with the lowest increase in both Kd(f) and Kd(s). The thermal sensitivity of swamp eel Mb was lower than those of the other Mbs for both of fast and slow reaction stages. These results suggest that the swamp eel Mb globin structure is thermally stable, which is consistent with heat-tolerant behavior of the swamp eel particularly in drought habitat.     

黄鳝源嗜水气单胞菌DB01分离鉴定及药敏特性研究

从患病的黄鳝(Monopterus albus)体内分离到一株致病菌株DB01,对该菌株进行人工感染、生理生化鉴定及16S r DNA序列分析。结果显示:人工感染黄鳝出现与自然发病相同的症状,表明菌株DB01为发病黄鳝的病原菌。菌株DB01为革兰氏阴性杆菌,无芽孢和荚膜,在兔血平板上能形成明显的β-溶血。序列分析显示,菌株DB01与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源性达99%。药敏试验结果显示,菌株DB01对诺氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等抗生素高度敏感,五倍子、黄柏、地榆及乌梅等中草药对菌株DB01抑菌作用强。     

黄鳝生态养殖技术

鳝鱼是一种喜居沟渠 ,田塍旁、池塘边 ,钻穴打洞 ,昼伏夜出摄食水中小昆虫 ,蚯蚓及浮游动物等食物的特种水产品 ,人工饵料养殖成本较高 ,靠收集野生饲料 ,常常货源不足 ,费时费力 ,如何解决饵料问题 ,笔者在湖南采用的黄鳝生态养殖技术做如下介绍 ,供参考。1　建池选用鱼池面积 334平方米 ,池深 1 5米 ,坡度 75° ,用水泥浆抹光 ,鱼池四周高 1米左右 ,池内浮泥深度 30厘米、池底为黄色硬质池底 ,将浮泥每隔 1米堆成高为 2 5厘米 ,宽为 30厘米的成“川”字形小田塍 ,池塘内周围留 1 5米左右的空地种草 ,供后期幼蛙生长的场所 ,用鱼网或薄膜…     

黄鳝养殖中的几个技术问题

黄鳝属底层鱼类 ,为长圆筒体型、营穴居生活 ,广泛分布于河道、湖泊、池塘、沟渠及稻田等浅水水体 ,白天隐匿在水底泥沙之洞穴中 ,夜间外出觅食。黄鳝喜生活于静水及微流水中 ,其适宜生长温度为 15～ 2 8℃ ,最适生长温度为 2 2～ 2 5℃。当水温降低到 10℃以下或升高到 30℃以上时 ,则停止摄食 ,钻入洞穴中越冬或度夏。黄鳝是底层肉食性鱼类 ,食量大、贪食 ,日摄食量占其体重的 1/ 7左右 ;也能忍耐饥饿 ,长时间无食不会死亡 ,但体重下降。黄鳝以各种小型水生动物为主要食物 ,喜食轮虫、枝角类、桡足类、水蚯蚓、昆虫幼虫及人工投喂的陆生蚯…     

鳝种的筛选技术

鳝鱼俗称黄鳝、田鳝或田鳗 ,为亚热带和温带广泛分布的淡水底栖生活鱼类。其肉质肥嫩 ,味道鲜美 ,营养丰富 ,具有滋补强身等药用功能。鳝鱼这种名贵的水产品 ,已进入寻常百姓家。目前鳝鱼人工繁殖技术尚未过关 ,养殖鳝鱼主要靠从市场上采购野生鳝种 ,若鳝种选择不慎 ,放养后成活率极低 ,致使养殖失败。从市场购买鳝种 ,必须严格挑选 ,钩钓鳝、电击鳝、鳝夹子夹的鳝一般不能用作鳝种养殖 ,最好采购用笼捉或锹刨的鳝。直接从捕捞者手中购入为佳 ,作为鳝种 ,暂养最好不超过两天。1　筛选鳝鱼的品种要想发展鳝鱼的人工养殖 ,首先要有好的鳝种。…     

海萝凝集素的分离纯化及性质

海萝(Gloiopeltis furcata)经PBS缓冲液抽提、硫酸铵分级、DEAE-52纤维素离子交换层析和SephadexG-200分子筛层析，从中纯化出海萝凝集素(GFL)，在PAGE和等电聚焦电泳上各显示单一蛋白染色带，其等电点为9．0。用SephadexG-200分子筛层析测得其相对分子质量为8318。海萝凝集素除对人血型红细胞无凝集活性外，对单胞藻及兔、鲤、鲫的红细胞均表现出一定程度的凝集活性，对兔红细胞的凝集活性最强，且不被已测试的D-果糖、D-半乳糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖所抑制，而被D-甘露糖、牛甲状腺球蛋白、鸡卵白蛋白、γ-球蛋抑制。该凝集素在pH4．0～10．2均有活性，而在pH6．5～9．1时活性较高。该凝集素在90℃加热1h，活力并未减弱，说明这种凝集素具有很强的耐热性。     

黄鳝血清白蛋白的纯化及抗体制备

通过阴离子交换层析和凝胶过滤层析,从黄鳝血清中得到其血清白蛋白,命名为MAA-serum,分子量为67kDa,为单链非糖蛋白,其N末端氨基酸序列为GHKKW。用0.5mg/只MAA-serum作为免疫源免疫大白兔,经3次免疫后,抽取大白兔血液,分离血清,饱和硫酸氨沉淀,获得抗MAA-serum的多克隆抗体。经ELISA方法测定该抗体与黄鳝血清白蛋白的免疫反应,抗体滴度为1∶100000。经初步研究发现黄鳝皮肤中也有大量血清白蛋白分布,该抗体为进一步研究MAA-serum在皮肤中的分布及生物学功能打下基础。