添加胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠对牛体外胚胎生产、低温保存及常规冷冻效果的影响

【目的】探究添加胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(insulin-transferrin-sodium selenite, ITS)对牛体外胚胎生产、4℃低温保存及常规程序冷冻效果的影响,以期应用ITS提高牛体外胚胎的生产及保存效果。【方法】对屠宰场卵巢来源的牛卵母细胞进行体外受精,(1)研究在胚胎体外培养后期液M2中添加ITS对囊胚率的影响,试验分为M2中添加ITS组(M2+ITS)和M2中未添加ITS的对照组(M2-control);(2)研究在M2中添加ITS后进一步在前期培养液M1中添加ITS对早期胚胎发育的影响,试验分为M1和M2中均添加ITS组(M1+M2+ITS)和仅M2中添加ITS的对照组(M1-control);(3)在三气培养条件下对ITS改善胚胎发育的效果进行评估,试验分为添加ITS组(ITS)和未添加ITS的对照组(control),以上各组均统计卵裂率、7 d囊胚率及总囊胚率;(4)将获得的7 d牛囊胚在添加ITS的M2保存液(Hypo-ITS组)中低温保存(4℃)24 h后复苏培养,或者在添加ITS(Cryo-ITS组)的冷冻保存液中常规程序冷冻解冻后培养,以低温...     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

基于ITS基因分析扩展莫尼茨绦虫种系发育关系

为研究扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列的遗传变异情况,并利用ITS序列探讨扩展莫尼茨绦虫与其它带科绦虫的种群发育关系,本研究利用PCR对扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列进行扩增、测序及分析。结果表明:16株扩展莫尼茨绦虫分离株核糖体ITS序列长度一致,为1462~1473bP,且分离株与基因库扩展莫尼茨绦虫位于同一大分支,可以与其它带科绦虫有效鉴别。说明ITS序列种内较为保守,种间差异较大,可以作为扩展莫尼茨绦虫的种间遗传变异研究的分子标记。     

斯氏副柔线虫rDNA-ITS片段的克隆及序列分析

运用PCR方法以保守引物NC5、NC13、NC13r和NC2扩增从内蒙古地区骆驼皱胃分离的3条斯氏副柔线虫（Parabronema skrjabini）rDNA的内转录间隔区1（ITS1）、5.8S序列和内转录间隔区2（ITS2）。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGM-T载体,用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落,对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明线虫1（P.sk1）扩增的ITS片段大小为837 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1（298 bp）、5.8S（157 bp）及ITS2（281 bp）序列;线虫2（P.sk2）扩增的ITS1片段大小为372 bp,包含部分的18S、5.8S及全部的ITS1（296 bp）;线虫3（P.sk3）扩增的ITS2片段大小为484 bp,包含部分的5.8S、28S及全部的ITS2（284 bp）序列。同其它属线虫同源性比较ITS2序列同源性在30.2%-60.1%。本研究系首次报道骆驼斯氏副柔线虫的ITS序列,为斯氏副柔线虫分子生物学的进一步研究奠定基础。     

我国狍子源鞭虫的分子鉴定与进化分析

为鉴定我国黑龙江省分离的狍子源鞭虫的种类及确定其在鞭虫中的分类地位,本研究首先对鞭虫进行形态学特征观察,并利用PCR方法扩增该鞭虫r DNA ITS序列,经测序分析结果表明,r DNA ITS序列全长为1 371 bp,其中ITS1、5.8S及ITS2大小分别为800 bp、163 bp及408 bp,与之前报道的狍子源鞭虫同源性达99.8%。将其与NCBI数据库中相应鞭虫ITS序列进行比对分析,并将r DNA ITS序列作为基因标记构建鞭虫属系统发生树,结果显示本研究所分离的狍子源鞭虫与其他不同宿主的无色鞭虫均处于同一个分支,因此可鉴定本研究分离的我国狍子源鞭虫为无色鞭虫。本研究为国内首次对狍子源鞭虫进行分子鉴定及系统进化分析,为草食动物的鞭虫病分子鉴别诊断和鞭虫系统进化分析研究提供依据。     

山羊美丽筒线虫ITS序列的PCR扩增及分析

以神木山羊体内分离出的美丽筒线虫为研究对象,用保守引物进行PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8S序列,并进行克隆、转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定.结果获得一个美丽筒线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长均为1 035 bp.将序列与GenBankTM公布的相关序列进行比较分析,结果显示美丽筒线虫分离株ITS1与参考株的相似性为98.1％～99.7％,ITS2、5.8S序列与参考株相似性均达到100％.本研究是第一次从山羊体内获得美丽筒线虫ITS序列,为其分子学的进一步研究提供了基础资料.     

西北部分地区猪蛔虫rDNAITS基因序列测定及遗传变异分析

为了摸清西北部分地区猪蛔虫内转录间隔区(ITS)的遗传变异特点,扩增了猪蛔虫ITS基因,进行测序,依据GenBank公布的ITS序列将测序结果截为ITS1、5.8S及ITS2三段,分析比对各段序列的差异性。结果显示,所有样品ITS序列长约1 000bp,其中ITS1、5.8S和ITS2的长度分别为450bp~453bp、159bp、272bp,种内差异分别为0~0.2%、0、0。基于ITS1的种系发育分析表明,23个猪蛔虫样品均位于同一分支,而与贝蛔属蛔虫分属两个不同分支。ITS1序列不能作为区分西北不同地区猪蛔虫的种内分子标记,但可以作为区分蛔属蛔虫与贝蛔属蛔虫的种间分子标记,研究结果为猪蛔虫的鉴定和分子流行病学调查提供了基础资料。     

河北兔场皮肤病原真菌rDNA-ITS序列分析

利用皮肤真菌核糖体内转录间隔区（ITS）序列通用引物,对采自河北省兔场的5种皮肤真菌病进行了PCR扩增,ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。经与GenBank核酸序列数据库数据比对和形态学观察结果表明：有4种真菌被鉴定,分别为须毛癣菌、多聚曲霉、球孢白僵菌和产黄青霉,1种未鉴定;不同病原菌的5.8SrDNA序列高度保守,而ITS区的变异性则较高。该研究确定ITS区序列分析可用于兔皮肤病原真菌的分离。     

猪蛔虫个体内ITS1序列差异比较

内转录间陋区1(ITS1)序列常被用于基因分型、物种鉴定和系统发育研究。论文比较猪蛔虫(Ascaris suum)个体ITS1序列差异。对采自江西的猪蛔虫样本进行DNA提取、PCR扩增rDNA的ITS1片段,并对该片段进行分子克隆、测序,使用MEGA5.0对测序结果进行比较。结果表明,同一个猪蛔虫个体的ITS1序列拷贝并不完全一致,总是会有个别的碱基差异,在polyA和polyT之间尤为明显,同一个猪蛔虫样本中含有多种基因型或单倍型,而且在试验中还发现了新的单倍型(HC1-HC5)。因此,将ITS1序列作为区分猪蛔虫基因型的依据值得商榷。     

两种鞭虫ITS序列的比较与进化分析

对猪鞭虫(Trichuris suis)和无色鞭虫(Trichuris discolor)的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行扩增、克隆和比较分析;以ITS序列为基因标记采取ML法构建系统发生树,确定它们间的亲缘关系。结果猪鞭虫ITS序列长1 397 bp,其中ITS1和ITS2序列长度分别为658 bp和585 bp。无色鞭虫ITS序列长1 404 bp,其中ITS1和ITS2序列长度分别为786 bp和455 bp,两者的ITS1与ITS2序列的同源性分别为55.8%和65.0%;进化分析显示两种鞭虫处于不同分支上,分别与Gen Bank上发表猪鞭虫和无色鞭虫序列聚集在一起,显示两者亲缘关系较远。     

蛇钩口线虫长沙分离株ITS基因的克隆及序列分析

为研究蛇钩口线虫长沙分离株的核糖体DNA (rDNA)内转录间隔区(ITS)序列的遗传变异情况,并利用ITS序列构建蛇钩口线虫与其它线虫的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增蛇钩口线虫rDNA的ITS片段,并克隆至pGEM-T载体中进行序列测定及分析.结果显示,长沙市各分离株的ITS序列长度均为734 bp,与其它线虫的同源性均低于83.9％,而与十二指肠钩口线虫的同源性较高.本研究为蛇钩口线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

基于ITS2序列的17种外来入侵 植物分子鉴定

中国入侵植物种类繁多、危害严重,对入侵物种的准确鉴定是开展各项研究的基础。本研究采用植物DNA条形码序列ITS2片段来探讨其在入侵植物中的鉴定能力。结果表明,ITS2序列在入侵物种及其近缘物种间存在明显的遗传差异,种间变异大于种内变异,在17种常见入侵植物与36种近缘物种的300份样品鉴定中成功率达95.5%。构建的NJ树可以很好地显示各不同入侵植物物种的聚类。此外,ITS2的二级结构也具有一定的系统学及分类学意义。因此,ITS2条形码序列能够作为入侵植物分子鉴定的有力工具,具有重要的应用价值。     

山东兔场皮肤真菌病病原rDNA-ITS区序列测定及分析

利用皮肤真菌核糖体内转录间隔区（Internal transcribed spacer,ITS）序列通用引物,对采自山东地区主要兔场的皮肤真菌病的16株分离菌进行了PCR扩增,ITS区的克隆、测序、序列变异及遗传进化关系分析。经与Gen-Bank核酸序列数据库数据比对结果表明：16株病菌分别为须癣毛癣菌（12/16,75%）、犬小孢子菌（2/16,12.5%）、石膏样小孢子菌（2/16,12.5%）;不同病原菌的5.8SrDNA序列高度保守,而ITS区的变异性则较高;对该区序列的聚类分析表明,不同种菌株ITS1比ITS2在碱基构成和序列长度上有更大变异;而种内各菌株的ITS1和ITS2在长度上均没有变异,碱基构成上存在微小的变异,可基于该区进行兔皮肤真菌的分类鉴定。该研究确定了兔皮肤病原PCR检测特异引物的靶序列,为兔皮肤真菌病病原的特异性分子鉴定提供了可靠的靶标,为兔皮肤真菌的科学分类提供了分子依据。     

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株，以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5．8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析，旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证。为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示：QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5．8S序列完全一致。且与GenBank上注册RH株的ITS及5．8S序列也一致；仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定。但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。     

肉牛源细极链格孢菌的分离鉴定

为鉴定肉牛皮肤病病原及其致病性并筛选其敏感药物,本研究取患皮肤病肉牛病变部位皮屑、毛发和痂皮进行病原菌的分离,并对分离菌株进行了形态学鉴定、ITS序列分析、小鼠致病性试验和药敏试验。结果显示分离到1株形态特征与细极链格孢菌极其相似的菌株(PY2-1-2);经PCR扩增、测序和BLAST序列比对,结果显示分离株(PY2-1-2)的ITS基因序列与细极链格孢菌(MG975630.1)的ITS基因序列的相似性为99%,分离株PY2-1-2的ITS基因序列长度为543 bp,该片段包括ITS1、5.8S rDNA和ITS2的全部基因序列以及18S rDNA和28S rDNA的部分基因序列,提交GenBank(MH656780.1)。根据形态学结合ITS基因序列分析结果确定该分离株为细极链格孢菌。小鼠致病性试验结果显示该菌对小鼠有致病性。药敏试验结果显示:该菌对灰黄霉素、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑的最小抑菌浓度(MIC)值分别为0.5μg/mL、4μg/mL、1μg/mL、1μg/mL。本研究为今后进一步探究细极链格孢菌引起的皮肤病诊治提供科学有效的参考。     

金荞麦内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

以2份金荞麦为材料,对其内转录间隔区ITS区序列进行PCR扩增,均获得长约700 bp的特异性产物。测序结果表明,金荞麦1号样品包含ITS序列660 bp,金荞麦2号样品包含ITS序列646 bp,在Genebank中的登录号分别为DQ780602和DQ780600。对现有金荞麦ITS的序列比对表明,其同源率为80.2%~93.1%,变异位点主要在ITS1,表现出较丰富的遗传多样性。采用邻接法构建了金荞麦的系统进化树。     

桑黄Y1菌株rDNA ITS序列的分子进化研究

桑黄是一种具有极高药用价值的真菌,但其分类及鉴定较为混乱。本研究克隆并测定了桑黄Y1菌株的rDNA ITS序列,对该序列的碱基组成、碱基替换数及序列同源性等进行分析;用Mega7.0软件邻接法(neighbor-joining, NJ)构建了基于桑黄rDNA ITS的系统发育树。结果表明:桑黄Y1菌株的rDNA ITS序列总长度为709 bp, rDNA ITS1和rDNA ITS2序列具有很多变异位点,存在序列多态性,其中rDNAITS1序列的碱基替换数比rDNAITS2的碱基替换数明显增多;系统发育分析表明木层孔菌属真菌可分为3个类群,桑黄属于鲍姆木层孔菌(Phellinus baumii),与裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)亲缘关系较近。研究结果可为桑黄的分类及鉴定提供一定的依据。     

犬皮肤癣菌病病原的分离及其ITS区序列分析

分离一例格力犬皮肤癣菌病的病原,并对其ITS区序列进行分析,以确定其种属。用沙氏培养基对病料进行分离、培养,根据菌落形态特征与镜检结果对分离到的病原菌进行初步鉴定,采用真菌鉴定通用引物ITS1及ITS4对分离菌的ITS区序列进行PCR扩增、测序,将测序结果进行对比分析,并对其亲缘关系进行系统发育分析。分离到的病原菌经形态学鉴定,被初步判定为小孢子菌属真菌,其ITS区序列与Gen Bank中的犬小孢子菌(ATCC 36299)的ITS序列(FJ 385030.1)相似性为99%,且在系统发育树上属同一分支。结果表明,引起该犬皮肤癣菌病的病原菌为犬小孢子菌。     

桑属植物ITS序列研究与系统发育分析

用PCR产物直接测序法对桑属的 9个种 3个变种共 13份桑种质和构属构树的ITS序列进行了测定。结果表明 :桑属植物ITS1长度平均约为 189bp;桑属 5 8SrRNA为 15 2bp ;ITS2长度平均为 2 12bp ;桑属植物ITS序列G +C含量为 6 0 %左右。用DNASTAR软件构建了桑属植物ITS序列的系统发育树 ,并探讨了参试桑种质的亲缘关系。     

内蒙古10种草原蝗虫和亚洲小车蝗不同地理种群的ITS2序列分析

为从分子水平对内蒙古草原蝗虫进行系统性研究,对内蒙古地区常见的10种草原蝗虫的120个个体的rDNA-ITS2序列进行扩增,通过与GenBank中已知蝗虫的ITS2对比得到180～197 bp的ITS2序列.使用MEGA 4.0软件对得到的ITS2序列进行对比,并对15个不同地点的亚洲小车蝗(Oedaleus asiaticus)种群进行比较分析.结果表明:10种蝗虫的ITS2序列的碱基组成显示出对鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的偏好性;15个地点的亚洲小车蝗种群之间差异小,仅有2个个体产生变异,共有11个变异位点,均为碱基的替换,占所测序列的5.67％.15个种群聚类结果显示,13个种群为一支先与四子王旗种群聚在一起,再与正镶白旗种群相聚;说明ITS2序列在蝗虫种下的遗传分化上为高度保守的序列,不适用于蝗虫种下遗传分化的研究.同属蝗虫之间的遗传距离为0.0000,说明ITS2序列也不能区分同一属蝗虫.槌角蝗科先与网翅蝗科聚类再与斑翅蝗科相聚,最后与斑腿蝗科相聚,反映了各科亲缘关系的远近.