蛋白质亚细胞定位预测研究进展

蛋白质的功能与其亚细胞位置有着密切的联系,对于确定一个未知特性蛋白质的功能,亚细胞定位研究能够提供重要的参考信息。采用传统实验的方法研究亚细胞定位需要耗费大量的人力、财力、物力,已经不能满足数据库中蛋白质序列爆炸性增长的现实需要。从已积累的知识和数据出发,利用智能算法、机器学习等工具开发蛋白质亚细胞定位预测的方法成为了当前的重要研究内容。本文对国内外亚细胞定位预测的研究现状进行了综述。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因结构预测及亚细胞定位

利用PCR方法扩增到VP1基因,序列测定后利用Mega4．0、swiss—model、GOR4和RasMol软件预测了VP1基因的二、三级结构。将VP1基因融合EGFP基因后定向克隆入PcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建正确的重组质粒命名为PVP1E,在脂质体介导下将PVP1E质粒转染BHK-21细胞,WesternBlotting试验证实VP1基因成功表达,经DAPI细胞核染色后在共聚焦显微镜下观察VP1亚细胞定位。结果表明本研究预测了VP1基因的二、三级结构,其在BHK-21细胞中呈现以细胞核为主的弥散性分布,VP1基因亚细胞定位及结构预测为进一步深入探究AsiaI型FMDVVP1结构和功能提供丰富的资料。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位研究

为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...     

家蚕ycaCR基因的表达特征及蛋白质的亚细胞定位

ycaC相关蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族成员。从家蚕蛹cDNA文库中检索到一条EST序列,编码一个含ycaC-related保守结构域的蛋白质,将该cDNA的全长序列命名为BmycaCR(GenBank登录号:GU292794)。通过基因克隆、原核表达和纯化技术得到BmycaCR蛋白,用纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot检测BmycaCR蛋白在家蚕卵期的表达水平明显高于其它发育时期,蛋白质在5龄幼虫的睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血液和丝腺中没有检测到阳性信号。荧光定量PCR检测BmycaCR在家蚕卵期的转录水平明显高于其它发育时期,在5龄幼虫各组织中,BmycaCR的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血液、马氏管、丝腺和头部。亚细胞定位显示BmycaCR蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,可能发挥基本的生物学功能,并在靠近质膜区域有强的荧光信号,可能具有与其它蛋白质相互结合的功能。     

家蚕组织中钙的亚细胞定位研究

应用锑酸盐沉淀技术研究家蚕中肠和马氏管的亚细胞钙离子分布，其螯合试验和电镜观察证明，用本试验方法产生的锑酸盐沉淀是锑酸钙，沉淀分布有规则，超微结构保存良好，是研究蚕体组织亚细胞钙离子分布较为有效的方法。作者应用这一技术观察了家蚕５龄幼虫中肠及马氏管组织的钙离子亚细胞分布，并发现氟中毒后马氏管组织的钙离子亚细胞分布有显著的变化，认为这一技术可为家蚕氟毒理研究提供一种新方法。     

非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系.作者使用Mega6.0软件绘制了 7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL软件预测了该基因所编码蛋白序列的二、三级结构;根...     

猪流感病毒聚合酶PB1蛋白亚细胞定位的研究

猪流感病毒PB1蛋白在其复制中起着转录作用,是病毒复制所必需的蛋白。克隆了猪流感病毒的PB1基因,构建重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-7.1-PB1,利用脂质体转染Vero细胞后,分别用Western blot和IFA检测重组蛋白FLAG-PB1蛋白的表达,结果表明重组蛋白能在真核细胞中得到表达,其亚细胞定位为细胞核表达,与其功能密切相关,为以后流感病毒的相关研究打下了基础。     

小鼠RSP3基因序列分析及其亚细胞定位

衣藻RSP3是一个鞭毛结构蛋白,目前有关RSP3相关研究主要集中在衣藻上,而对其在哺乳动物中的同源基因的蛋白定位及功能研究甚少。本研究对各个物种的RSP3氨基酸序列进行比对分析,在用SMART软件预测小鼠RSP3结构域的基础上构建了小鼠RSP3真核表达载体,并在CHO细胞中成功表达,应用荧光共定位技术研究小鼠RSP3与微管、内质网及高尔基体的关系。结果表明,小鼠RSP3比衣藻RSP3在N端多出127个氨基酸,两者都含有一个RSP3结构域,RSP3结构域是一个微管结合结构域,而且在进化中高度保守。在CHO细胞中表达的小鼠RSP3并不直接与微管结合,也不定位在内质网或高尔基体,进一步研究发现其聚集分布于细胞质基质中,而且主要分布在细胞核的周围。说明RSP3在进化中较为保守,但在哺乳动物中的分布和功能可能与在衣藻中有所不同。     

非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明，非洲猪瘟病毒（ASFV） MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答，故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列，进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法，分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构；根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）序列，合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒，Western blot验证该基因表达后，将重组质粒转染至PK-15细胞，经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明，以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照，其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守，在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致，保守序列为3'末端378 bp片段，高级结构以α螺旋为主，核定位序列预测其定位于细胞核内；构建真核表达质粒，成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。     

蓝舌病病毒新型NS4蛋白的亚细胞定位分析及功能预测

蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)编码4种非结构蛋白(NS1~NS4),其中NS4是新发现的非结构蛋白。为深入探索该新型非结构蛋白的功能,本研究首先采用生物信息学分析其序列结构特征及可能的功能域,结果发现NS4蛋白的N端α-螺旋结构域中具有富含碱性氨基酸的核定位信号(NLS),而C端α-螺旋结构域中具有亮氨酸拉链结构的核输出信号(NES)。为进一步证实NS4的亚细胞定位,本试验构建了表达NS4全长及其缺失突变体的重组质粒,结果显示缺失NLS的NS4重组蛋白弥散在胞浆,而缺失NES后NS4重组蛋白只定位于细胞核,表明NS4蛋白亚细胞定位具有核-胞浆穿梭过程。最后结合3D同源建模发现NS4与CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPβ)等具有较高的同源性,据此推测NS4可能为转录调控蛋白,与DNA或其他转录因子存在相互作用。总之,本研究为NS4蛋白的功能研究提供了更多新线索和新思路,填补了BTV基础研究的空白。     

鸡Piwi蛋白的亚细胞定位研究

通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-Piwi,脂质体PEI介导基因转染NIH-3T3细胞,同时构建pcDNA3.1-Piwi真核表达载体,采用细胞间接免疫荧光方法检测Piwi蛋白在NIH-3T3细胞的表达部位。结果表明,成功克隆出公鸡Piwi基因的全序列CDS,大小为2 604bp,与GenBank中预计的序列基本一致;融合表达载体pEGFP-C1-Piwi在整个细胞中都有表达;而间接免疫荧光方法检测到pcDNA3.1-Piwi载体主要在NIH-3T3细胞质中表达。Piwi蛋白主要在细胞质中表达,采用间接免疫荧光方法比EGFP报告基因法更为可靠,适合目的蛋白的亚细胞定位研究。     

布鲁菌分泌蛋白BspG的亚细胞定位分析

本研究旨在确定布鲁菌分泌蛋白BspG在宿主细胞中的亚细胞定位.通过生物信息学分析预测BspG蛋白序列特征及功能域,构建立体模型;使用常规分子克隆技术以布鲁菌16M株为模板进行目的基因扩增,构建pMD19-T-BspG克隆载体及pDsRed2-C1-BspG重组真核表达载体,真核载体转染HEK293T细胞,RT-PCR检...     

家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT-α亚基的鉴定和亚细胞定位

CCT(chaperonin containing T-complex polypeptide 1,或称TRiC)是一种广泛存在于真核细胞中的伴侣蛋白,主要参与真核细胞中细胞骨架蛋白β-tubulin和actin的折叠和组装。CCT-α亚基作为单体或复合体在细胞骨架蛋白的折叠和组装中起着关键作用。对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的CCT-α基因(NbCCT-α)进行鉴定和表达分析,该基因包含一个全长1 629 bp的完整ORF,编码由542个氨基酸组成的蛋白质。NbCCT-α的分子质量为59.662 kD,等电点(pI)为5.81,无信号肽和跨膜结构域。亚细胞定位结果表明,NbCCT-α蛋白位于休眠孢子的细胞质和质膜上,并在孢子萌发结束后转移到胞原质表面。在微孢子虫增殖时期,NbCCT-α蛋白不仅存在于细胞质中,还存在于核周和细胞膜。此外,NbCCT-α基因转录水平从感染后24 h开始升高,感染后96 h时达到最高,暗示CCT-α可能在家蚕微孢子虫的增殖中发挥作用。该研究为进一步探索NbCCT-α蛋白的功能奠定了基础。     

紫花苜蓿MADS-box基因NMH7的亚细胞定位与表达分析

通过构建NMH7基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体GFP- NMH7研究紫花苜蓿基因编码蛋白的亚细胞定位.用基因枪轰击洋葱表皮细胞的方法进行瞬时表达,结果表明:NMH7基因编码蛋白定位于细胞核;半定量RT- PCR分析紫化苜蓿NMH7基因的组织表达特性,结果表明:其在根、花蕾、花、荚果中都有表达,在花中表达量高于其他组织;NMH7基因的表达不受赤霉素诱导,脱落酸和茉莉酸甲酯能抑制其表达.     

犬瘟热病毒V蛋白的表达、鉴定及亚细胞定位

为研究犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV） V蛋白的功能,将CDV V基因片段与pGEX-6P-1载体连接,构建pGEX-6P-1-CDV-V重组表达质粒,通过原核表达系统表达了V蛋白,并将纯化的V蛋白免疫BALB/c小鼠,制备阳性血清。同时,将CDV V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-CDV-V重组表达质粒,经转染Vero细胞后,用激光共聚焦技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,成功表达了V蛋白,并制备了阳性血清。重组质粒pcDNA3.1-CDV-V在外源真核细胞Vero中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。本试验结果为进行CDV V蛋白的功能研究奠定了基础。     

鸡Dazl基因的克隆及其亚细胞定位研究

为克隆鸡Dazl(Deleted in azoospermia-like,Dazl)基因CDS序列,通过构建eGFP标记的DAZL真核表达载体,实现该基因产物的亚细胞定位以探究其生物信息学功能.提取1日龄鸡睾丸总RNA,通过巢式PCR方法扩增出Dazl基因的CDS,构建真核表达载体pEGFP-C1-DAZL.采用LipofectaminTMLTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染CEF细胞,48 h后于荧光倒置显微镜下观察其表达定位,同时利用RT-PCR和Western-blot进一步鉴定eGFP-Dazl和蛋白水平的表达情况.结果表明:克隆出Dazl基因的完整CDS,长度870 bp,共编码289个氨基酸,与公布的鸡Dazl基因(GenBank登陆号:NM_204218)CDS区同源性达99％,编码氨基酸完全一致.酶切鉴定和序列分析均表明真核表达载体pEGFP-C1-DAZL构建成功.转染48 h后,RT-PCR和Western-blot分别检测到949 bp特异条带和59.7 ku的融合蛋白.荧光显微镜观察显示,融合蛋白(eGFP-Dazl)主要分布于细胞核.     

Asia 1型口蹄疫病毒前导蛋白（L^pro）亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白（Lpro）亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L。利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶（PI）染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位。结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDV L基因在BHK-21细胞中得到表达;Western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布。     

Asia1型口蹄疫病毒前导蛋白(Lpro)亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)前导蛋白(Lpro)亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L.利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting.方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶(PI)染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位.结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDVL基因在BHK-21细胞中得到表达;western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布.     

家蚕冷激蛋白BmCSP的表达及亚细胞定位分析

冷激蛋白是一种多功能RNA/DNA结合蛋白,其特征是存在1个或多个冷激域,不仅可以调节自身的表达,还可以调节许多与疾病相关基因的表达,并协调多种细胞过程,包括增殖和分化。家蚕体内存在一个冷激蛋白(Bombyx moricold shock protein,BmCSP),通过构建重组表达载体pET-28a-BmCSP进行表达纯化和多克隆抗体制备,制备的抗体效价大于1∶12 800。通过实时荧光定量PCR和免疫印迹(Western blotting)对家蚕各个发育时期及5龄幼虫各个组织的BmCSP基因和蛋白质的表达水平进行检测,发现在5龄幼虫期和5龄幼虫生殖腺的表达水平最高,而蛾期和头部中的表达水平最低。推测BmCSP蛋白可能在家蚕生殖过程中发挥一定作用。通过免疫细胞化学技术在家蚕卵巢细胞中进行亚细胞定位分析,发现BmCSP蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞质中,但在4℃冷激2 h后,BmCSP蛋白则同时位于细胞核和细胞质内且表达水平上升。推测BmCSP蛋白在冷激情况下向细胞核内迁移,可能对家蚕细胞处于低温条件下保护细胞核正常的生理活动和细胞存活起重要作用。