基于重构NDRV σC 蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立灵敏快速诊断新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus, NDRV)抗体的间接ELISA (indirect ELISA,iELISA)方法,为水禽养殖业提供科学有效的检测手段。先前报道σC蛋白为沉淀表达,因此本研究利用大肠杆菌的密码子偏嗜性等规律优化其基因序列进行原核表达,纯化出高纯度的可溶性σC蛋白。采用方阵滴定法确定σC蛋白包被浓度和样品稀释度,初步建立NDRV的iELISA检测方法。分别对84份阳性和180份阴性质控血清进行分析,构建受试者工作特征曲线(ROC),通过Youden指数选择灵敏性和特异性最佳的P值作为阴阳临界值。使用质控阴、阳血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究的和实验室先前建立的全病毒包被的iELISA方法同时对质控血清进行检测,比较其符合率。通过方阵滴定法确定各组分条件为σC蛋白包被质量浓度0.5μg/孔、血清稀释度1∶320。构建的ROC曲线下面积为1.00,最佳阴阳临界值为0.076,在此临界值上的灵敏性和特异性均为100%。全病毒包被板和σC蛋白包被板符合率为100%,但前者检测样品的D₄₅₀值偏低,σC...     

番鸭呼肠病毒抗体间接ELISA方法的建立

用硫酸铵粗提的番鸭呼肠病毒作为包被抗原,成功地建立了检测番鸭呼肠病毒抗体的间接ELISA方法。结果表明,包被抗原作1∶80稀释,待检血清作1∶40稀释,酶标二抗作1∶200稀释,是最佳的工作浓度,而且该法特异性高,重复性好,质量稳定,敏感性强,结果可靠,是一种适合于流行病血清学调查的快速、敏感、准确、特异、重复性好的方法。     

ELISA检测禽呼肠孤病毒抗体方法的建立及应用

建立了一种检测禽呼肠孤病毒(ARV)抗体的敏感方法——ELISA法。用此法对某鸡场血清样品进行检测,琼扩检出阳性率为65%,ELISA检出阳性率为100%,ELISA方法明显比琼扩敏感。另外,用ELISA方法诊断出江苏某鸡场发生的鸡病毒性关节炎,并用ELISA法筛选出8株分泌ARVMcAb的杂交瘤细胞株。ELISA方法因其特异、敏感、可靠,将成为SPF鸡群,祖代鸡群净化ARV的有效检测手段。     

草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

研究以纯化的羊抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体作为捕获抗体,抗草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体为检测抗体,建立草鱼呼肠孤病毒抗原捕获ELISA检测方法,其最佳反应条件是：羊多克隆抗体包埋浓度为2.5μg/mL,抗草鱼呼肠孤病毒单克隆抗体工作浓度为1:400稀释,以3％牛血清白蛋白作为封闭液。该方法的检测限为5×105 pfu/mL,且能够特异性检出发病草鱼内脏组织中的草鱼呼肠孤病毒。特异性试验结果表明该方法具有较高的特异性,与病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和鲤春血症病毒等水产动物病毒株均不反应。该方法还具有较好的稳定性。     

直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立

本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测.     

鹅圆环病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)抗体的检测方法,本研究通过原核表达重组核衣壳(Cap)蛋白,将纯化的该重组蛋白作为ELISA检测的包被抗原,利用交叉反应性,以羊抗鸡IgG(HRP-IgG)作为二抗,经反应条件的优化,建立了检测鹅血清GoCV抗体的间接ELISA方法。确立的ELISA反应最适条件为:抗原包被浓度为2.05μg/mL,待检血清稀释度为1∶50,HRP-IgG稀释度为1∶2000,待测血清和二抗均于37℃反应1.5h,底物于室温显色10 min。经38份阴性血清检测确定阴阳性临界值为0.25。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌、新城疫、禽流感H5和H9、小鹅瘟、鹅副粘病毒抗原阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果显示,其批内和批间变异系数均小于10%。应用该方法检测了从4群GoCV PCR检测阳性种鹅群采集的血清,结果显示其血清阳性率在60.0%～90.9%。本实验建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,为进一步开展GoCV流行病学调查提供了一种便捷可靠的手段。     

禽呼肠孤病毒σNS和P17非结构蛋白作为ELISA鉴别诊断抗原的研究

表达并纯化了禽呼肠孤病毒(ARV)的2个非结构蛋白σNS和P17,并以此作为包被用抗原,分别进行间接ELISA。结果表明,抗原最佳包被浓度分别为9.3μg/mL和11.5μg/mL;一抗血清的稀释度都是1∶200;HRP酶标二抗羊抗鸡IgG稀释度为1∶5 000,初步建立了能检测ARV感染的σNS-ELISA、P17-ELISA方法。以σNS、P17两种蛋白按以上确定的条件同时包被,建立了σNS-P17-ELISA。分别用σNS-ELISA、P17-ELISA及σNS-P17-ELISA对接种过ARV活病毒或灭活疫苗的33份SPF鸡血清进行检测,结果发现以非结构蛋白建立的3种ELISA方法均能区分ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的抗体,进一步对这3种方法进行敏感性、特异性分析比较,表明σNS-P17-ELISA方法能更有效地区分ARV感染与灭活疫苗免疫抗体。     

犬瘟热病毒重组H蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测水貂犬瘟热病毒(CDV)血清抗体的间接ELISA方法,将CDV的血凝素蛋白(H)基因的主要抗原表位片段克隆至p ET-30a-c(+)载体中,转化至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。以纯化的重组H蛋白作为包被抗原,建立了检测CDV抗体的间接ELISA方法,并证实该方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。采用建立的方法与国外商品化的犬瘟热抗体检测试剂盒对80份血清进行检测,两者符合率为92.5%。本研究建立的间接ELISA方法为水貂抗体水平检测和评价犬瘟热疫苗免疫效力提供了简便快速的方法。     

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和westem-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15m mol/LIPTG诱导,5h后融合蛋白δC表达量可达高峰,分子量为50ku;融合蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测鸭血清中的呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,最佳包被浓度为51μg/ml;标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40;用该方法对50份鸭血清样品进行检测,并与琼扩抗体检测法相比较,证明该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,该研究为今后鸭呼肠孤病毒的诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

间接ELISA检测新型鸭瘟病毒抗体

以50%饱和度的硫酸铵粗提病毒,再经Sephadex G-200过柱层析纯化了新型鸭瘟病毒,以此作为包被抗原,并用自制油苗免疫雏鸭,获得了高效价的血清抗体,又经过各种条件优化,建立了检测血清抗体的间接ELISA方法.经对不同发病日龄和免疫油苗后雏鸭的血清检测,证明该检测方法有很高的敏感性、特异性和重复性,可作为快速诊断该病的一种可靠方法.     

鸭肠炎病毒NP蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

设计一对特异性引物扩增出鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因,并将其定向插入到原核表达载体pET32a上,构建了NP基因的原核表达载体pET-NP;将重组载体pET-NP转化表达宿主菌BL21后,经SDS-PAGE分离后行Western blot显示,获得的表达产物具有良好的免疫原性;应用His.Bind亲和层析柱纯化重组NP蛋白,并以此作为包被抗原,初步建立了检测鸭肠炎病毒抗体的iNP-ELISA;经方阵滴定确定,重组蛋白抗原的最佳包被浓度为5.0μg/L,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判定标准为:待检血清OD405值≥1.2,且待检血清OD405和阴性血清OD405的比值≥2.0;应用iNP-ELISA对450份鸭血清样本进行检测,结果iNP-ELISA与全病毒包被的iDEV-ELISA符合率达90.9%。     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

以重组PvpA蛋白作为抗原的鸡毒支原体抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立鸡毒支原体(MG)种特异性检测的间接ELISA检测方法,本研究以原核表达的PvpA蛋白作为包被抗原,初步建立了检测MG抗体的间接ELISA检测方法.特异性试验结果表明,重组PvpA蛋白与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、滑液支原体、大肠杆菌“O”抗原、禽沙门氏茵“O”抗原阳性血清均不发生交叉反应.该方法的批内变异系数小于8％,批间变异系数小于11％,表明具有较好的重复性.采用该检测方法与进口试剂盒对不同省份送检的鸡血清进行检测比较,两者阳性和阴性符合率均达到90％以上.本研究建立的间接ELISA检测方法为MG抗体检测试剂盒的研制奠定了基础.     

茨城病毒VP7蛋白基因的克隆表达及间接ELISA方法的建立

采用RT-PCR方法扩增出了茨城病毒（IBAV）No．2株编码VP7蛋白的S7全长基因，并克隆入原核表达载体pET-28a（＋）中，在E．coli BI.21中表达。经Western-blot检测，表达的重组VP7蛋白具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，初步建立了检测IBAV血清抗体的间接ELISA方法。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

为建立一种快速检测流行性乙型脑炎病毒抗体的方法,本研究参照已发表的JEV基因组序列,应用RT-PCR扩增了长约1000bp的E基因片段,连接pET30a表达载体中,经诱导后获得了以包涵体形式表达的重组E蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明其具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测流行性乙型脑炎病毒抗体的E-ELISA诊断方法。该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为JEV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和JEV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

鸭源呼肠孤病毒Sigma A蛋白的原核表达及免疫活性检测

为制备新型鸭源呼肠孤病毒(DRV) THIl株Sigma A蛋白的多克隆抗体,本研究采用RT-PCR方法扩增DRV TH11株Sigma A的编码基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达.采用SDS-PAGE和western blot对表达产物进行鉴定.结果表明,Sigma A基因不仅可以在大肠杆菌中高水平表达,表达产物的分子量约66 ku,而且表达产物能够被特异性DRV多克隆抗体识别,证明表达的Sigma A蛋白具有良好的免疫活性.以纯化的Sigma A蛋白免疫实验兔制备抗Sigma A蛋白的多克隆抗体,间接ELISA检测结果显示其效价达1:20000以上.间接免疫荧光试验表明,多克隆抗体能够特异性识别DRV的Sigma A蛋白,表明Sigma A蛋白具有良好的免疫原性.本研究为进一步研究Sigma A蛋白的功能,以及建立DRV检测方法奠定了基础.     

猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立

猪流感病毒A／Swine／Fujian／668／2001（H3N2）株感染的鸡胚尿囊液，经差速离心后，再经蔗糖密度梯度离心，提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融，作为猪流感间接ELISA抗原，确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测，经统计学分析，确定间接ELISA判定标准，被检血清OD490nm值≥0．20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应，批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3．34％～8．12％和6．2％～9．04％之间。与HI的符合率达到92．8％，经卡方检验（P〈0．01）比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。     

口蹄疫病毒2C3AB基因的原核表达及ELISA方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)的2C蛋白中存在对自然感染和灭活疫苗免疫动物具有鉴别诊断意义的抗原表位。为建立一种敏感的血清学鉴别诊断方法,本研究截取FMDV 2C蛋白的C端B细胞表位较为富集的区域与全长3AB基因组合,经原核表达获得分子量约为44 ku的目的蛋白。Western blot分析表明,表达产物2C3AB与FMDV感染动物的阳性血清呈特异性反应。以纯化的目的蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,敏感性检测表明该方法比3ABC-ELISA具有更高的敏感性;同时检测猪圆环病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒标准阳性血清均无交叉反应。批内和批间重复性试验显示,OD450nm值的变异系数小于9%。采用该方法检测不同背景的临床样品,并与3ABC-ELISA及进口试剂盒比较,总符合率分别为98.5%和90%。结果表明,该ELISA检测方法具有更高的敏感性和良好的特异性、重复性。