传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3 260bp、B节段长度2 827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96.8%⁹8.1%和96.9%98.1%和96.9%⁹8.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%98.4%,处在IBDV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%⁹0.4%和90.0%90.4%和90.0%⁹0.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段77790.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777⁷82位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnⅠ酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。     

传染性法氏囊病病毒BC6/85株全基因组克隆及其序列分析

以传染性法氏囊病病毒（IBDV）BC6／85株基因组RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增并克隆了IBDVBC6／85株基因组全长eDNA。序列测定结果表明：A节段全长共3260个核苷酸,与IM株的同源性最高为97．4％,与其他血清I型毒株的核苷酸同源性介于91．2％～97．1％;B节段有2827个核苷酸,与IM株同源性最高为98．6％,与其他毒株的核苷酸同源性为88．7％～98．6％。通过对编码的氨基酸序列进行分析,发现BC6／85株有21个特有氨基酸,其中15个位于多聚蛋白VP2—4—3。系统进化树分析表明,BC6／85株与经典毒株、弱毒株和变异株的关系较近,而与超强毒株相对较远。     

传染性法氏囊病病毒 PY05 株的分离鉴定

为了分离到鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）病毒,从河南省濮阳地区某疑似感染鸡法氏囊病病毒的鸡场采集病料,用SPF鸡胚对病毒进行分离培养,通过琼脂扩散试验和RT-PCR扩增VP4片段对其进行鉴定。结果显示该毒株能引起鸡胚规律性死亡,且出现CAM增厚、鸡胚出血等明显病变;待检抗原、标准阳性血清之间出现阳性沉淀线;琼脂电泳得到大小约为1200bp片段,与预期结果相符。结果证明该分离株为IBDV地方株,并命名为PY05株。     

应用Dot－ELISA快速检测传染性法氏囊病病毒

本文成功建立了斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ），应用于传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的快速检测。该方法操作简便快速、特异性好、灵敏度高。同时对深圳某鸡场发生ＩＢＤ病料进行了病毒分离，用Ｄｏｒ－ＥＬＩＳＡ检测接种鸡胚的绒毛尿囊膜裂解上清呈强阳性反应。     

应用Dot－ELISA快速检测传染性法氏囊病病毒

本文成功建立了斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ），应用于传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的快速检测。该方法操作简便快速、特异性好、灵敏度高。同时对深圳某鸡场发生ＩＢＤ病料进行了病毒分离，用Ｄｏｒ－ＥＬＩＳＡ检测接种鸡胚的绒毛尿囊膜裂解上清呈强阳性反应。     

传染性法氏囊病病毒Gt株基因组A节段的克隆和序列分析

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV-Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,使其成为弱毒株IBDV-Gt.从细胞适应毒中提取病毒dsRNA,通过反转录,使用Long-accurate PCR(LA-PCR)用一对引物一步直接扩增IBDV-Gt基因组A节段全长cDNA的方法,得到一约3.30kb的片段.测序结果证明已获得3255bp的A节段全长,对vvIBDV-Gx株和IBDV-Gt株的全部核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明IBDV-Gt株与国内外数株IBDV弱毒株的同源性在99%以上.     

传染性法氏囊病病毒超强毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比较

根据已发表的５２／７０株ＩＢＤＶ基因组序列,设计并合成了一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以陕西地区分离的ＩＢＤＶ野毒ＸＮ株,ＨＺ株为材料,以其基因组为模板利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ＰＵＣ１１９质粒上,得到重组ＰＵＣ１１９质粒。     

1株传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

【目的】 研究1株传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）广西分离株的毒力特征及其与VP2基因序列特征的关系,为IBDV的流行病学研究和疫病防控提供参考。【方法】 通过PCR、鸡胚传代培养、DF-1细胞的适应培养及琼脂扩散试验等方法分离鉴定病毒,并扩增其VP2基因,利用Mega 7.0、MegAlign软件将其与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及氨基酸序列比对分析,并进行SPF鸡致病性试验,用实时荧光定量PCR方法测定IBDV拷贝数变化情况。【结果】 成功分离到1株IBDV毒株,命名为GX20210126株。该毒株接种SPF鸡胚可导致鸡胚出现出血、矮化和肝脏发黄、出血及针尖状坏死;且GX20210126对DF-1具有良好的细胞适应性,可引起显著细胞病变。琼脂扩散试验显示,该毒株具有良好的抗原性,病毒液能与IBDV阳性血清之间形成白色沉淀线。VP2基因进化分析显示GX20210126株与国际标准超强毒株在同一个大的分支上,氨基酸序列相似性在86.8%~99.6%之间,其中与UK661株相似性最高,为99.6%,仅有2处氨基酸位点发生改变,即D279N和I272T。以EID₅₀为10^-3.8/0.1 mL,0.5 mL/只的剂量点眼、滴鼻接种8日龄SPF鸡,攻毒后鸡出现羽毛蓬松、精神萎靡、拉白绿色水样粪便等临床症状,剖检可见肌肉、肝脏出血,肾脏尿酸盐沉积,法氏囊萎缩,IBDV拷贝数在感染后第5天达到峰值。【结论】 IBDV广西流行株GX20210126具有超强毒株基因序列特征,人工感染鸡群可导致IBDV典型临床症状和病理变化。     

用DIG－标记核酸探针鉴定传染性法氏囊病病毒

用ＤＩＧ－标记ＩＢＤＶｃＤＮＡ探针进行斑点杂交试验鉴定传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）。实验结果证明，该探针能与试验的１０株ＩＢＤＶ的ＲＮＡ发生限性杂交反应，结果清晰稳定，无非特异性反应。本试验是一种新的敏感的ＩＢＤＶ鉴定方法。     

传染性法氏囊病病毒VP2单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

为研制传染性法氏囊病病毒（IBDV）快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验（IFA）证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异（P〉0.05）。     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行毒株的免疫原性

从河北省一些发病鸡场分离到JD1～JD10共10株鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒株,用IBD标准阳性血清以琼扩试验进行了初步鉴定.并进行了IBDV分离物及其鸡胚适应毒免疫原对标准强毒IBDV-BC6/85株免疫保护试验,D78弱毒疫苗对IBDV各分离毒株的免疫保护试验以及分离毒株间交互免疫保护试验.结果表明,D78疫苗对JD2,JD5和JD10 IBDV分离株的保护率较低,分别为40%、50%和60%.分离毒株JD5、JD2及其鸡胚传代物E-JD2对强毒株的免疫保护率可达100%.交互免疫保护试验表明,JD2对其余各分离株的免疫保护指数达到80%以上,对标准强毒株和地方分离株均可产生有效免疫保护.     

传染性法氏囊病病毒抗原表位分析--单克隆抗体的制备与鉴定

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株ZB和TA3的细胞培养物采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法浓缩纯化病毒,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了6株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系1C1、1E6、2B2、2G8、3A2、3E2。间接ELISA测定,杂交瘤细胞培养上清液的抗体效价为102,诱生腹水的抗体效价为106～107。相加ELISA分析,这6株单克隆抗体对应不同的病毒抗原表位。中和试验结果表明,2G8对病毒有较强的中和能力,腹水的中和效价为105。用2B1和3E2配对建立的夹心ELISA可特异地检测IB DV。     

金丝桃素粉剂对人工感染传染性囊病病毒鸡的疗效试验

金丝桃素是从贯叶连翘中提取的一种极具抗病毒活性成分。为了研究金丝桃素粉剂对腔上囊的治疗效果,对20日龄雏鸡人工感染传染性囊病病毒(IBDV BC-6/85)后,以不同的剂量连续4d口服金丝桃素粉剂。通过观察腔上囊和肌肉的出血情况,以及病原分离,评价该药物对鸡传染性囊病的治疗效果。结果表明:以667.9mg/kg体重的金丝桃素粉剂连续口服给药4d,能有效的治疗传染性囊病,效果优于对照药物高免卵黄抗体。     

传染性法氏囊病病毒感染细胞内源性microRNA表达差异分析

细胞内源性microRNA（miRNA）在宿主与病原相互作用过程中发挥着重要的调节功能。为了分析细胞内源性miRNA与传染性法氏囊病病毒（IBDV）的相互作用,用IBDV弱毒和强毒分别感染鸡胚成纤维细胞（CEF）和SPF鸡,24h后,取感染CEF和法氏囊组织,提取细胞总RNA,用Hy3/Hy5双色荧光标记,与miRNA芯片杂交,进行芯片内标准化、芯片间标准化、表达差异比较以及聚类分析。结果显示：在IBDV弱毒感染的CEF中,有17个细胞内源性miRNA表达上调,17个miRNA表达下调;在IBDV强毒感染的鸡法氏囊组织细胞中,有30个细胞内源性miRNA表达上调,18个miRNA表达下调。根据表达差异显著的miRNA序列设计引物,用荧光定量RT-PCR方法验证芯片检测结果,2种方法的检测结果一致。结果表明,IBDV感染可诱导细胞内源性miRNA表达变化,这些上调或下调的miRNA能调控细胞内多种代谢和信号传导途径发生异常,引起细胞及组织器官发生病理学变化。     

Immunoreactivity and morphological changes of bursal follicles in chickens infected with vaccine or wild-type strains of the infectious bursal disease virus

Infectious bursal disease (IBD) is characterized by immunosuppression due to the depletion of lymphocytes in the atrophied bursa of Fabricius (BF). We have sometimes encountered contradictory findings: chickens infected with the vaccine IBD virus (IBDV) strain have sometimes exhibited a highly atrophied BF, but not immunosuppression. In this study, chickens administered vaccine or wild-type strains of IBDV were later vaccinated with the B1 strain of the Newcastle disease virus (NDV). Bursal changes were examined histologically with a focus on the bursal follicle. The immunoreactivity to NDV was also evaluated with the hemagglutination inhibition test. In gross examination, we observed a few chickens with a severely atrophied BF in vaccine strain-administered groups (vaccine groups), and the level of severity was the same as that in the wild-type strain-administered group (wild-type group). However, these chickens retained humoral antibody responses to NDV and were revealed to possess a higher number of bursal follicles than those of the wild-type group. These results indicated that macroscopic evaluation dose not accurately reflect the immunoreactivity and degree of bursal damage in IBDV-administered chickens. We also found non-immunosuppressed chickens in the wild-type group. These non-immunosuppressed chickens retained a significantly higher number of normal follicles and total follicles according to our statistical analysis. Furthermore, a high correlation coefficient between the NDV-HI titer and the number of normal follicles was found in the wild-type group. These results implied that the retained number of normal follicles is important for the immunoreactivity of chickens infected with IBDV.     

抗鸡IBDV Gt株单克隆抗体制备及抗原表位初步分析

采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒Gt株免疫BALB/C小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过三次筛选克隆,获得具有分泌抗IBDV抗体的7D_4、5D_2两株杂交瘤细胞系,并对7D_4及5D_2株进行了特异性、稳定性等方面的鉴定。试验表明,两株分泌的抗体能够特异地与IBDV VP2蛋白反应。7D_4株及5D_2株杂交瘤细胞上清ELISA效价分别为1：250、1：50,腹水ELISA效价为6．4×10~6、5×10~3；并运用7D_4、5D_2介导的相加ELISA进行抗原表位的初步定位,这两株单抗针对不同的VP2抗原表位。     

鸡传染性法氏囊病病毒DK株VP2基因序列分析及其对SPF雏鸡的致病力

为探究鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)DK分离株的致病性和遗传变异情况,本研究测定了该分离株的鸡胚半数致死量(ELD50)、对SFP雏鸡的致病力以及扩增病毒的VP2基因并分析其序列。结果显示,DK分离株对鸡胚的ELD50为104.5/0.2mL,以2×10^3ELD50剂量感染SFP雏鸡出现典型IBD的临床症状、剖检和组织学病变;实验鸡发病率为100%,致死率为44.4%;DK株VP2基因序列与参考株的同源性为93.1%~97.0%、氨基酸序列同源性为93.6%~97.5%,其基因序列和氨基酸序列均与Cu-1wt参考株(经典株)同源性最高;DK株VP2氨基酸序列的七肽区SASWSGS及249Q、253Q、279D、284A、290M、313V、330S氨基酸位点均与强毒株的氨基酸位点一致;但其222P、256V、299N3个氨基酸不符合IBDV超强毒株的特征;而其第222、249位氨基酸为P和Q,与抗原变异株(vIBDV)的T和K也不相同。结果表明:IBDVDK株为中等偏强毒力病毒。本研究为IBD的防控提供参考依据。     

传染性法氏囊病病毒对鸡法氏囊组织中干扰素和p53转录的影响

为了分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染对鸡体抗病毒天然免疫能力的影响,本研究应用IBDV弱毒(B87)和强毒(QL/12)分别感染4周龄SPF鸡,每隔12h(12~84h)取3只鸡的法氏囊组织作为1个pool,用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其感染前后干扰素(IFN)和p53的mRNA水平,同时分析法氏囊组织的病理变化和病毒载量。结果显示:在QL/12组,IFN-α和IFN-βmRNA水平随着时间的增加逐渐升高,48h达到峰值,随后降低;IFN-γmRNA水平随着时间的增加逐渐升高,60h达到峰值,随后逐渐降低;p53mRNA含量迅速升高,60h达到峰值,随后降低。在B87组,IFN-αmRNA水平先降低后升高(48h达到最低值),而IFN-βmRNA水平变化不规则,72h含量最高;IFN-γmRNA水平先逐渐升高后降低(72h达到峰值);p53mRNA含量变化较小,36h含量最高。QL/12组诱导法氏囊组织产生的IFN mRNA(IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA)以及p53mRNA水平均显著高于B87组。病理组织学检查,QL/12组法氏囊淋巴滤泡呈不同程度的损伤,而B87组法氏囊组织未见明显的组织病变。qRT-PCR检测,QL/12组法氏囊组织中病毒含量48h达到峰值(8.4×106拷贝/mg),而B87组法氏囊组织中病毒含量72h达到峰值(6.6×104拷贝/mg)。本研究结果表明IBDV感染严重干扰了鸡体IFN和p53介导的抗病毒天然免疫反应。