鸭坦布苏病毒山东流行株的分离鉴定及其基因组序列分析

为了解山东省鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV)的流行与变异情况,对2018年下半年至2019年上半年泰安、济宁和淄博等地送检的临床病鸭样品进行了DTMUV病原学检测,并对阳性病料进行病毒分离鉴定及分离株的全基因组序列分析。结果显示:从102份样品中,共检测到8份DTMUV阳性,阳性率检出率为7.8%,从阳性病料中分离到3株DTMUV分离株;3个分离株基因全长均为10 993 bp,彼此间的氨基酸同源性为99.2%～99.3%,与24个参考毒株的同源性为95.8%～99.9%,均属于中国株I型;与参考毒株相比,分离株的核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E和非结构蛋白NS1的同源性相对较低,分别为86.1%～99.2%,95.0%～99.4%和92.3%～99.7%,同时存在数量不等的氨基酸突变位点,但关键的蛋白结构和潜在的糖基化位点无差异。结果表明,DTMUV在山东部分地区仍有流行,但流行毒株基因结构及致病特性与经典毒株相比无明显变化,但应持续关注和深入研究。     

鸭坦布苏病毒SC2013株的分离鉴定

利用RT-PCR从疑似鸭坦布苏病毒感染的致死产蛋鸭的肝、脾和卵泡膜等组织中扩增出鸭坦布苏病毒E基因,并利用10日龄鸭胚分离出病毒SC2013株。该毒株对氯仿和胰蛋白酶敏感,不凝集鸡红细胞;E基因核苷酸序列与坦布苏病毒GX2013G(Gen Bank:KM275941.1)的相似性在99%以上;对10日龄鸭胚的半数致死量为10-4.59/0.2 m L,人工接种能引起2日龄雏鸭发病死亡并呈现典型的临床症状与病理变化。以上结果表明,分离病毒SC2013株为致病性的鸭坦布苏病毒,在今后养鸭业中除注重鸭坦布苏病毒对产蛋鸭的危害外,也应加强防止幼龄鸭感染。     

鸭坦布苏病毒江苏XZ株的分离和鉴定

从江苏徐州地区分离到的以引起樱桃谷鸭产蛋下降和死亡为特征的1株病毒,命名为XZ株。对该病毒进行电镜观察、血凝试验、ELD₅₀测定、RT-PCR扩增特异性目的基因、序列比对分析和动物回归试验。结果显示,分离毒株能致死鸭胚和鸡胚,电镜下观察到球形病毒粒子,不具有血凝性,对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,均可扩增出基因片段,其核苷酸序列与坦布苏病毒奉贤株的相似性最高,为98.7%,与其他坦布苏病毒的毒株也具较高同源性,为86%~98%。用鸭胚分离毒株接种健康产蛋鸭,能复制出同样的疾病。结果表明分离病毒为鸭黄病毒属的坦布苏病毒。     

鸭坦布苏病毒研究进展

2010年以来中国大部分种鸭和蛋鸭养殖地区相继发生了以减料、产蛋下降和伴有一定死淘率为特征的传染病。该病发病急,传播快,死淘率高,给中国的养禽造成巨大的经济损失,仅2010年给中国的养鸭业造成的损失达50亿元。随着研究的深入,该病被确诊为是由一种新型病毒-鸭坦布苏病毒引起的传染病,本文围绕着该病的流行病学、临床症状、病理变化、病毒生物学特性、病毒检测方法及致病力等方面的研究进展进行综述,旨在为鸭坦布苏病的防控提供科学依据。     

鸭坦布苏病毒FJ42株的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解福建地区鸭坦布苏病毒(DTMUV)的流行和遗传进化情况,本研究将2019年11月采集自福建某蛋鸭养殖场中经PCR检测为DTMUV阳性的病鸭卵巢组织样品处理后接种SPF鸡胚,盲传3代后收集尿囊液进行PCR检测和鸡红细胞凝集试验.将第3代尿囊液以1 mL/只的剂量接种200日龄产蛋鸭进行动物回归试验,分别于感染后6d...     

鹅源坦布苏病毒的分离及初步鉴定

从表现神经症状、软脚的雏鹅中分离到1株病毒,暂命名为GD06株,经RT-PCR检测初步认定所分离到的病毒为坦布苏病毒.序列分析表明,GD06株与鹅源坦布苏病毒JS804株的核苷酸同源性高达99.8％,与鸭源坦布苏病毒(WR株、BYD-1株和SD株)核苷酸同源性分别为99.1％、99.8％和99.8％;与鸡源坦布苏病毒FQ-C1株的同源率高达98.5％;与坦布苏病毒和以色列火鸡脑膜炎病毒的同源性分别为88.3％和76.1％,系统进化分析表明,GD06株病毒与坦布苏病毒共处同一分支.     

鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

【目的】 了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】 通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】 分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】 成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。     

1株麻雀源坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

从山东地区某发病鸭场周围的麻雀体内分离到1株坦布苏病毒,命名为SDS株,并对分离毒株进行毒力测定。应用RT-PCR技术对分离株全基因组进行扩增并测序,将获得的SDS株坦布苏病毒全基因组序列与已在Gen Bank发表的24株坦布苏病毒和6株其他黄病毒属病毒全基因组序列进行遗传进化分析。结果表明,该株坦布苏病毒的基因组全长为10 990 nt,包含94 nt的5'端非编码区、618 nt的3'端非编码区和一个开放阅读框(3 425个氨基酸),编码11种病毒蛋白;与Gen Bank已发表的坦布苏病毒的核苷酸序列同源性为98.2%~99.5%,氨基酸序列同源性为98.1%~99.4%,其中与鸭源WFZ株(KC990545.1)的核苷酸序列同源性最高为99.5%,与鹅源坦布苏病毒(duck eggdrop syndrome virus strain goose,JQ920424.1)和鸡源坦布苏病毒(CJD50,JF926699)的核苷酸序列同源性较低为98.9%。用Net NGlyc 1.0 Server在线软件对病毒蛋白潜在糖基化位点进行预测,结果表明在SDS株病毒多聚蛋白中共有13个潜在的糖基化位点,分别位于5个不同病毒蛋白中。     

鸭坦布苏病毒致病特性及其流行病学

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种可引起鸭产蛋量下降、采食量下降的新发病毒.自2010年4月以来,该病导致中国东南沿海地区的养鸭业遭受了巨大的经济损失,并迅速蔓延至我国各主要养鸭省市.本文综述了该病的病原学、流行病学、临床症状和病理学变化及检测方法,为进一步研究鸭坦布苏病毒提供参考.     

雏鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因序列分析

山东潍坊地区某鸭场养殖的21日龄樱桃谷鸭突然发病,病鸭主要表现翅腿瘫痪等神经症状,排黄绿色或黄白色稀粪,病死率5%左右。为了确定发病鸭群感染病原的种类,首先采集病死鸭肝脏,处理后接种9日龄~11日龄SPF鸡胚进行病原分离。其次,对分离的病原RT-PCR扩增和序列测定,MEGA5绘制系统发育进化树,DNA Star软件分析核苷酸同源性。结果表明,通过SPF鸡胚分离到一株坦布苏病毒(TMUV),命名为TMUV-SDWF。该病毒株基因组全长为10 990nt,编码1个含3 426个氨基酸的多聚蛋白。系统发育进化树分析显示,TMUV-SDAG毒株属于Ⅰa分支。核苷酸同源性分析表明,TMUV-SDSG与GenBank上公布的16株不同TMUV分离株核苷酸同源性高达97.0%~99.8%。成功分离鉴定一株鸭坦布苏病毒并对其进行了遗传进化分析,为鸭坦布苏病毒弱毒或灭活疫苗的筛选制备及该病毒分子流行病学的研究奠定了基础。     

猪流感病毒的分离与鉴定

从广东某猪场表现发热和流鼻涕等呼吸道症状的猪群采集28份样品,用鸡胚分离到9株病毒。将病毒传代至第6代,经血清学鉴定、理化特性检查、电镜观察、生物学特性检查和人工致病试验,结果表明,4株分离株为H1N1亚型猪流感病毒,5株为H3N2亚型猪流感病毒。     

高致病性猪蓝耳病病毒吉林株的分离鉴定及生物学特性

从吉林某猪场采集曾接种过猪繁殖与呼吸综合征疫苗的发病猪病料,经RT-PCR初步鉴定为猪繁殖与呼吸综合征病毒后,利用反转录合成cDNA,用针对PRRSV M、N基因片段设计的特异性引物进行扩增及电泳,在紫外凝胶成像系统下可见约为660bp特异性扩增条带。解剖发病仔猪,发现其有HP-PRRSV发病的特征,两耳及鼻端淤血,呈蓝紫色,肺部等内脏器官淤血呈暗红色。病理组织切片显示,病猪有典型的间质性肺炎的特征性病理变化。将其接种于Marc-145细胞后,在培养至第4代时出现典型的细胞病变（CPE）,表现为细胞聚集成丛、随后固缩、变圆、脱落;经Reed-Muench法计算得出两PRRSV分离株的病毒滴度分别为10-5.30 TCID50/0.1mL和10-5.53TCID50/0.1mL。用间接免疫荧光试验观察到在接种病料的Marc-145细胞胞浆内出现特异性荧光,而未接种PRRSV的细胞对照则未见到荧光反应。     

13株新城疫病毒强毒株的分离鉴定及部分生物学特性

2004年-2005年从黑龙江省11个地区鸡场、鸽场、鹅场疑似新城疫(ND)病死鸡、鸽、鹅体内分离到24株具有血凝活性的病毒,经HA、HI试验和电镜观察证实了13株病毒为NDV。其鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(IC-PI)分别为36.8 h~73.6 h和1.51~2.00之间,属于NDV强毒株或中强毒株。除HLJ-12-04株外,强毒株的血凝素热稳定性较差,属快速或中速血凝解脱型;弱毒株的血凝素热稳定性好,属慢速血凝解脱型。所有毒株均可较好地凝集鸡和人(O型血)的红细胞,但对其他动物的红细胞凝集性差异较大,对马和兔的红细胞凝集无规律。     

鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗构建及免疫原性的初步研究

鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染引起产蛋鸭产蛋急剧下降.目前,没有预防该病的疫苗.为研究DTMUV DNA疫苗的免疫效果,本研究将DTMUV的E基因插入pCAGGS载体,构建了重组质粒pCAGGS-E.将pCAGGS-E转染293T细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot检测E蛋白的表达情况.结果显示,两种方法均检测到了E蛋白的特异性表达.将pCAGGS-E用脂质体包裹后通过尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况.结果表明,随着免疫次数的增加及免疫时间的延长,免疫小鼠的抗体滴度逐渐升高.本研究证明,编码E基因的重组质粒DNA免疫小鼠后能够诱导有效的免疫应答,为DTMUV DNA疫苗的研究奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定

本研究从吉林某牛场表现严重腹泻症状濒死牛的胸腺病料样品中分离一株病毒,该病毒在MDBK细胞中盲传4代无细胞病变产生,而通过RT-PCR和间接免疫荧光试验、微量血清中和试验检测表明该分离病毒株为牛病毒性腹泻病毒(BVDV),并命名为BVDV-JL.将BVDV-JL株F4代细胞培养液(10<'7.13>TCID<,50>/...     

Tembusu virus infection in Cherry Valley ducks: The effect of age at infection

Three groups of Cherry Valley ducks at 5 day, 2 week and 5 week of age were intranasally infected with the WFCL strain of Tembusu virus (TMUV) to investigate the effect of host age on the outcome of TMUV infection. For each age group, clinical signs, gross and microscopic lesions, viral copy numbers in tissues and serum neutralizing antibody titers were recorded. Age-related differences in the resistance to TMUV infection were observed with younger ducks being more susceptible. Some ducks infected at 5 day and 2 week of age developed severe clinical signs, including severe neurological dysfunction and death. However, subclinical signs and no mortality were observed in ducks infected at 5 week of age. A decline in the severity of gross and microscopic lesions was observed as ducks mature. Systemic infections were established in the three age groups post challenge. Higher viral copy numbers in the tissues, especially in vital organs such as the brain and the heart, were developed in the ducks infected at 5 day of age than older ducks, correlating with the severity of clinical signs and lesions in the tissues. Furthermore, ducks infected at 5 week of age developed significantly higher serum neutralizing antibody titers than ducks infected at 5 day of age as determined by serum neutralization test. Therefore, age-related differences in the resistance to TMUV infection should be considered when studying the pathogenicity, pathogenesis, formulation of the vaccination and therapy strategies of TMUV infection in ducks.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株的分离与鉴定

从河南省某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该病毒能在 Marc-145细胞上增殖并产生特征性的细胞病变 (CPE),在 Vero、PK-15细胞上不出现CPE.该病毒能被猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清特异性地中和,用 PCR反应能扩增出 720 bp的特异性片段.分离病毒回归 30日龄仔猪可出现高热和呼吸道症状.初步鉴定该分离株为猪繁殖与呼吸综合征病毒.     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性分析

为调查南京地区猪流感流行情况,本研究于2011年2月～5月期间从南京某屠宰场采集健康猪的鼻拭子和肺脏组织样品共690份,常规无菌处理后进行RT-PCR检测,将检测为阳性的样品接种9日龄～11日龄SPF鸡胚分离猪流感病毒(STV).对分离株进行血凝试验、EID50测定、HA及NA基因测序分析和感染小鼠及猪体试验.结果有18份样品RT-PCR显示为SIV阳性,但只有一株可在SPF鸡胚中稳定增殖.该病毒分离株具有凝集0.5％鸡红细胞的活性,EID50为10-6.32/0.1 mL,基因测序显示其HA、NA基因片段均与09年H1N1型流感流行株A/California/04/2009 (H1N1)高度同源,将其命名为A/Swine/Nanjing/50/2011 (H1N1).小鼠人工感染试验表明该分离株可引起小鼠死亡(3/10),猪体人工感染实验显示该分离株还能够引发猪体明显的流感症状及肺部病变.该病毒的分离鉴定及HA、NA基因序列分析为进一步调查SIV的流行规律提供了基础数据.