具有免疫作用的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白特性研究

外膜蛋白是细胞膜的重要成分之一,在免疫方面的作用日益受到关注,对其深入研究可使开发有效的多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗成为可能,本文就多杀性巴氏杆菌概况、组成及具有免疫作用的外膜蛋白的特性进行综述,以期推动多杀性巴氏杆菌疾病的诊断和防治。     

禽多杀性巴氏杆菌血清型与外膜蛋白型相关性研究

为了解禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)分离菌株的荚膜血清型、菌体血清型与外膜蛋白型之间的相关性,首先对自行分离的10个菌株采用间接血凝试验和琼脂扩散试验进行鉴定(均为A:1);然后采用超声波破碎、高速离心和十二烷基肌氨酸钠提取外膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳的方法对上述10个菌株与...     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白和脂多糖的免疫保护效果

为确定禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的保护性抗原外膜蛋白(OMPs)和脂多糖(LPS)在抵抗感染中的作用,本研究提取了禽P.multocida CVCC 474的OMPs和LPS成分,将该两种成分分别与弗氏佐剂混合制备免疫原,进行动物免疫。小鼠分为4组:OMPs组、LPS组、禽P.multocida弱毒活疫苗组和PBS对照组,每组16只。各组均免疫3次,每次间隔两周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。以禽P.multocida强毒株CVCC 474进行攻毒,计算小鼠死亡数及保护率。实验结果表明,动物免疫后,OMPs组与LPS组免疫小鼠特异性血清抗体水平持续升高,与弱毒活疫苗组水平相近,与PBS组相比差异极显著(p<0.01)。脾淋巴细胞增殖试验表明,OMPs组、LPS组和弱毒活疫苗组的SI值极显著高于PBS对照组(p<0.01),但3个免疫组之间则无明显差异(p>0.05)。攻毒保护试验结果显示,OMPs免疫组的保护率与弱毒活疫苗相当,为8/10,高于LPS免疫组的保护率(7/10),表明OMPs作为研制禽P.multocida亚单位疫苗具有良好的...     

多杀性巴氏杆菌病研究进展

多杀性巴氏杆菌(P.multocida)是引起多种畜禽巴氏杆菌病(pasteurellosis)的病原菌,主要引起动物发生出血性败血病或传染性肺炎。动物之间相互传染,人被动物咬伤可感染。畜禽巴氏杆菌病的防治主要使用多杀性巴氏杆菌疫苗.目前防制巴氏杆菌病的疫苗主要有强毒灭活菌苗、弱毒菌苗和亚单位疫苗,这些疫苗在一定程度上对巴氏杆菌病的防治起到了一定的作用,但由于多杀性巴氏杆菌的血清型多,免疫效果也不理想,有关巴氏杆菌病防治还有待进一步研究。本文就多杀性巴氏杆菌的毒力因子、免疫原等进行综合阐述。     

禽多杀性巴氏杆菌血清型与外膜蛋白型相关性研究

为了解禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)分离菌株的荚膜血清型、菌体血清型与外膜蛋白型之间的相关性,首先对自行分离的10个菌株采用间接血凝试验和琼脂扩散试验进行鉴定(均为A:1);然后采用超声波破碎、高速离心和十二烷基肌氨酸钠提取外膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳的方法对上述10个菌株与C48-1(A:1)、X73(A:1)、P1059(A:3)、CU(A:3,4)等一起进行外膜蛋白(Outer membrane proteins,OMP)分型研究。结果表明:14个禽多杀性巴氏杆菌菌株以2个主要蛋白OmpH和OmpA的差异为依据分为3种主要OMP型;依据次要蛋白的差异,OMP-1,3菌株进一步分为OMP型1.1,1.2和3.1,3.2,其中OMP型1.1有6个菌株,OMP型1.2有5个菌株;OMP型2有1株(YZ7031);P1059为OMP型3.1;CU为OMP型3.2;另外,血清型为A:1的12个菌株中有11个菌株外膜蛋白型均为OMP-1型,血清型为A:3、A:3,4的菌株外膜蛋白型属于3型。说明禽多杀性巴氏杆菌血清型与特定的外膜蛋白型具有很强的相关性。     

血清1和3型多杀性巴氏杆菌铁调控外膜蛋白共同抗原的初步分析

用普通BHI和缺铁BHI培养基培养禽多杀性巴氏杆菌C48-19（血清1型）、P1059株（血清3型）,提取外膜蛋白（OMPs）,SDS-PAGE电泳比较不同培养条件下两株细菌的外膜蛋白,发现缺铁培养时2株细菌均增加了87、81、79、64、60．5ku铁调控外膜蛋白（IROMPs）。以C48-19株攻毒后耐过的鸡血清作为抗体进行免疫印迹,检测到其中的87、79和60．5ku蛋白是2株细菌共同的、具有交叉免疫反应性的IROMPs,推测这3种蛋白可能是这2个菌株的共同抗原,并可能在C48-19感染的鸡体内特异表达;对鸡胚尿囊液中培养的C48-19株OMPs的SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验,也观察到类似IROMPs的表达。这些IROMPs的发现为亚单位疫苗的研制提供了候选蛋白。     

禽源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白A间接ELISA方法的建立

为建立基于重组外膜蛋白A的检测禽源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA方法,扩增去除信号肽的外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)基因,定向克隆到载体pET32a,构建重组表达质粒pET32a-PmOmpA,转化至Escherichia coli BL21(DE3)以IPTG进行诱导,通过镍离子亲和层析纯化重组蛋白,进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法,方阵滴定法确定其最佳包被浓度和血清的最佳稀释度。结果,重组蛋白能与阳性血清发生良好的免疫反应。重组蛋白的包被浓度为4mg/L,血清的最佳稀释度为1∶80。SPF鸡的新城疫、鸡白痢和大肠杆菌病阳性血清,隔离饲养的番鸭鸭瘟、鸭病毒性肝炎和鸭疫里默氏菌病阳性血清,用该方法检测均为阴性。板内变异系数和板间变异系数均小于10%。ELISA方法的敏感性比直接凝集试验高出80倍以上。以重组外膜蛋白A建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性和敏感性,可以用于禽霍乱感染性抗体的检测,也可用于禽霍乱灭活苗和荚膜疫苗免疫效果的检测。     

牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的表达与纯化

试验对多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H(OmpH)基因进行克隆、鉴定,并在原核系统中表达。以多杀性巴氏杆菌(CVCC448)强毒株基因组为模板,扩增OmpH基因,连接T载体,经测序鉴定正确后与表达载体pET-28a连接构建重组表达质粒OmpH-pET28a,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli BL21菌株内,抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导,表达产物通过镍离子亲和层析纯化,之后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果显示,OmpH基因的编码区为978 bp,编码326 个氨基酸残基,融合蛋白分子质量约为37 ku。Western blotting检测结果显示,表达的重组蛋白OmpH可与鼠抗多杀性巴氏杆菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。多杀性巴氏杆菌OmpH基因的成功表达,为进一步研究其免疫作用奠定了基础。     

禽多杀性巴氏杆菌C48—1成熟外膜蛋白H重组亚单位疫苗免疫效果的研究

将融合表达禽多杀性巴氏杆菌成熟外膜蛋白H（OmpmH）的重组菌pGEX—ompmH／BL21大量培养，在最佳诱导条件下诱导表达，表达产物经蛋白酶剪切及亲和层析纯化，得到OmpmH基因的原核表达产物，将其与弗氏完全佐剂混合制成油乳剂亚单位疫苗，用该疫苗肌肉注射接种5周龄鸡，首免后每周采血检测抗体，二免后第2周用10LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果显示，OmpmH具有良好的免疫原性，能诱导鸡体产生特异性抗体，可抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击，免疫效果优于禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗。     

Adherence of Pasteurella multocida to fibronectin

For many pathogens, adherence and/or invasion involve association with host extracellular matrix molecules, such as fibronectin (Fn). Pasteurella multocida was found to bind significantly to Fn and collagen type IX but not to laminin and collagen types IV and X. The binding of P. multocida to Fn was dose-dependent and was inhibited by heparin (Hep). Removal of polysaccharide capsule enhanced the binding capacity of the bacterium to Fn and inhibition by Hep. Protease treatment of bacteria decreased binding, implicating surface protein(s) as adhesive components. Investigation of the binding domain(s) of P. multocida on the Fn molecule revealed preferential binding to the N-terminal Hep-binding domain of Fn but not to the carboxyl-terminal Hep-binding domain. Furthermore, Fn, and anti-Fn antibodies inhibited P. multocida adherence to Madin-Darby bovine kidney cells, suggesting the involvement of Fn in the bacterium adherence to host cells. Ligand blotting, batch affinity purification and MALDI-TOF mass spectrometry implicated several proteins as putative adhesins of P. multocida in the Fn-mediated adherence. Taken together, the data suggest that P. multocida-Fn interaction may play a role in the bacterium adherence to host cells, and this may be mediated by bacterial surface proteins with preferential affinity for the Hep-1 binding domain of Fn.     

禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因克隆及序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR方法扩增出禽巴氏杆菌5：A C48-1株的ompH全长片段，将ompH进行T—A克隆、序列测定和分析。结果表明，ompH全长1597bp，含有一个1056bp的开放性阅读框架（ORF），编码352个氨基酸，前20个氨基酸组成信号肽。与已知的15个血清型及痘苗株CU的ompH的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较，核苷酸同源性在51．5％～98．7％之间，氨基酸同源性在39．3％～98，7％之间。氨基酸多序列比较显示，血清型特异性抗原表位位于60～80位和200～220位氨基酸处。     

猪多杀性巴氏杆菌对HeLa细胞附着能力的研究

本研究通过猪肺疫的活菌疫苗和死菌疫苗多杀性巴氏杆菌菌株(Pasteurella multocida,Pm)对小鼠的毒力试验测定它们的毒力性。结果表明,死菌疫苗Pm的毒力性比活菌疫苗Pm的强,即死亡率分别为10 0 %和0 %。通过两菌株对He L a细胞的附着试验测定它们的附着能力,结果证明强毒菌的附着能力明显地比弱毒菌强(P<0 .0 1) ,平均附着数分别为11.96和2 .4 4 ;从上述菌株细胞荚膜中分别提取荚膜蛋白,用SDS- PAGE分离测定两菌株荚膜蛋白质结构,结果表明39k Da荚膜蛋白是强毒菌的特异性蛋白。以上研究结果证明Pm的毒力与He L a细胞的附着能力是密切相关的,同时暗示本菌39k Da荚膜蛋白可能与它们的毒力和He L a细胞的附着能力有关     

禽源多杀性巴氏菌外膜蛋白的提取及其对小鼠的免疫原性观察

用EDTA—溶菌酶系统处理无荚膜的5:A型禽多杀性巴氏菌,得到无粘肽层的细胞膜.蔗糖密度梯度离心,将细胞膜分成3部分.琥珀酸脱氢酶、还原型辅酶I-2,6 二氯酚靛酚(NADH-DICP)氧化还原酶和NADH氧化酶的活性以及脂多糖含量测定表明,这3部分分别是细胞内膜、细胞外膜和混合膜.用高压液相色谱法从分离的外膜中提纯外膜蛋白,获得2个主要成分P_1和P_2.将P_1和P_2分别免疫小鼠,其保护率分别为20%和90%.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,P_2是一种主要的外膜蛋白,分子量为52000.     

大灰袋鼠多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年5月,北京动物园饲养的1只大灰袋鼠急性死亡。解剖发现其胰腺、心肌、大网膜、肾上腺等大面积出血。无菌采集肝、脾、大网膜接种于血琼脂培养基,分离到一株细菌。对细菌纯培养物进行形态学观察,并分别做氧化酶、触酶、糖发酵等生化特性试验,初步判定为多杀性巴氏杆菌。同时,API鉴定系统显示,该菌为氧化酶阳性、触酶阳性。API20E鉴定试纸鉴定为多杀性巴氏杆菌,鉴定百分率为90%。用该菌的培养物对6只小白鼠做致病性试验。6只小鼠均于6 h内死亡,经剖检均从心血中分离到较纯的多杀性巴氏杆菌。进一步说明分离到的菌株为多杀性巴氏杆菌。     

产毒素多杀性巴氏杆菌的鉴定

采用菌落多重PCR方法对分离保存的28株多杀性巴氏杆菌进行种型和毒素基因的检测,结果表明,菌株C51-6、M-4和P-2237为产毒素多杀性巴氏杆菌,菌株C51-6和P-2237为荚膜血清D型,菌株M-4为荚膜血清A型。同时用金黄色葡萄球菌抑制试验、中性吖啶黄沉淀试验和豚鼠皮肤坏死试验对PCR方法进行了验证。基于对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,3株菌株鉴定为多杀性巴氏杆菌多杀亚种。