绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP8的结合特性分析

气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是参与昆虫嗅觉感知过程的一类重要蛋白,其功能之一是结合运输外界气味分子通过淋巴液到达神经元树突。本文克隆了一个绿盲蝽Apolygus lucorum(Meyer-Dür)气味结合蛋白AlucOBP8(GenBank登录号JQ675725)并进行了原核重组表达。组织表达谱分析表明,AlucOBP8基因主要在雌雄成虫触角表达。采用荧光竞争结合试验,研究了重组蛋白AlucOBP8与7种性信息素类似物和33种植物挥发物的结合能力。结果显示,7种性信息素类似物均不能与AlucOBP8有效结合,而植物挥发物中只有葎草烯(α-caryophyllene)和十二醛(dodecyl aldehyde)与AlucOBP8表现出较强的结合,结合常数分别为8.74和9.99 μmol/L。绿盲蝽雌雄成虫对这两种化合物的趋向结果表明,十二醛对绿盲蝽雄成虫具有显著的驱避作用。初步推断AlucOBP8为普通气味结合蛋白并参与寄主普通挥发气味的识别过程。     

腰果角盲蝽气味结合蛋白基因HtheOBP3的克隆及组织表达分析

为明确腰果角盲蝽Helopeltis theivora气味结合蛋白3(odorant binding protein 3,OBP3)功能及其嗅觉感受机制，利用PCR技术结合c DNA末端快速扩增（rapid amplification of c DNA ends,RACE）技术克隆其cDNA全长序列，利用多个生物信息学软件对其进行序列分析，并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测其在腰果角盲蝽成虫不同组织中的表达量。结果显示，腰果角盲蝽HtheOBP3基因（GenBank登录号为QHI06949）开放阅读框为474 bp，编码157个氨基酸残基，预测蛋白分子量约为17.15 kD，等电点为5.14，无信号肽和跨膜结构，蛋白氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸残基和性信息素结合蛋白-普通气味结合蛋白（pheromone binding protein-general odorant binding protein,PBP-GOBP）家族的保守结构域。HtheOBP3蛋白具有6个α-螺旋和3对二硫键，其中5个α-螺旋形成1个结合口袋。腰...     

花椒窄吉丁气味结合蛋白AzanOBP5的克隆与表达

为进一步明确花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白AzanOBP5在昆虫嗅觉识别过程中的功能,基于花椒窄吉丁转录组数据(SUB6796283)利用cDNA末端快速扩增技术对花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5进行全长克隆并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量检测技术测定基因AzanOBP5在成虫不同组织中的表达情况。结果显示,克隆获得基因AzanOBP5全长740bp(GenBank登录号为MT318834),5''端非编码区为172bp,3''端非编码区114bp,开放阅读框453bp,编码150个氨基酸。序列分析表明,AzanOBP5氨基酸序列与苹果小吉丁Agrilus mali AmalOBP5的氨基酸序列一致性最高。成功构建pET-21a-AzanOBP5重组质粒并在大肠杆菌Escherichia coli中表达,经过诱导和纯化条件的优化及Western blot鉴定,得到的融合蛋白His-AzanOBP5大小符合预期。基因AzanOBP5在雌雄成虫的不同组织中均有表达,其中在成虫腹部的表达量最高。表明花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5除参与嗅觉识别过程外,还可能具有其他生理功能。     

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1（GenBank 注册号GQ178086）cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域（CBD）组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白（HA-CBP-1）序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白（HG-CBP-1）序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白（HS-CBP-1）序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。     

绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP33配体结合特性

本文研究了绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP33的配体结合特性,以期明确其在绿盲蝽化学感受过程中的生理功能。基于前期绿盲蝽触角转录组测序数据,筛选获得候选气味结合蛋白AlucOBP33。三维结构预测显示,AlucOBP33由6个α螺旋构成,包含3对保守的半胱氨酸,属于classic OBPs。室内对AlucOBP33基因进行了克隆和重组表达,采用荧光竞争结合试验研究了重组AlucOBP33蛋白与潜在的73种挥发性气味及13种味觉化合物的结合特性。结果显示,AlucOBP33重组蛋白能够分别与2种醇类、4种酮类、1种酯类、1种醛类和1种烯烃类的挥发性气味以及4种非挥发性化合物结合,推测AlucOBP33在绿盲蝽嗅觉感受和味觉识别过程中发挥双重功能。     

禾谷缢管蚜气味降解酶鉴定及其与关键信息化学物质的分子对接

为探究禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi气味降解酶(odorant degrading enzyme,ODE)与关键信息化学物质的作用模式,从其触角转录组中筛选属于ODE的细胞色素P450与谷胱甘肽-S-转移酶,利用IQ-tree 2.1.1软件构建进化树;根据FPKM值筛选出高表达蛋白,用SWISS-MODEL软件进行同源建模;并应用AutoDock软件与寄主植物挥发性气味和信息素进行分子对接。结果表明,筛选获得禾谷缢管蚜细胞色素P450基因30个,谷胱甘肽-S-转移酶基因10个,且40个基因均有完整的开放阅读框;根据FPKM值筛选出9个在禾谷缢管蚜触角表达量较高的基因,其中同源建模成功的有5个;同一蛋白与不同气味分子结合时,结合能有差异;结构相似的气味分子与不同蛋白结合时,结合位点与结合能相似。表明与气味结合蛋白相比较,禾谷缢管蚜ODE对气味分子的选择特异性较低。     

桃小食心虫成虫GOBPs与PBPs的基因克隆及表达谱分析

基于桃小食心虫Carposina sasakii触角转录组测序数据,利用RACE技术克隆了桃小食心虫2个普通气味结合蛋白GOBPs和3个性信息素结合蛋白PBPs全长基因,分别命名为CsasGOBP1、CsasGOBP2、CsasPBP1、CsasPBP2和CsasPBP3。5个基因的核苷酸序列全长分别为617、811、755、795和561bp,开放阅读框分别为504、492、507、492和498bp;蛋白分子量分别为16.6、16.34、16.5、15.76和16.66kDa,等电点分别为4.85、4.92、5.41、4.91和4.93,并具有的6个典型保守的半胱氨酸位点。进化树分析结果表明,5个基因能够与其他鳞翅目昆虫中的GOBPs和PBPs聚在不同的分支。qPCR对其雌雄不同部位表达谱分析发现,5个基因均在雄虫触角中显著表达,在头、胸、腹、足和翅中低量表达。该研究为更好地了解其在桃小食心虫嗅觉识别过程中的作用奠定了基础。     

悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库的构建及质量分析

为了研究铜绿丽金龟(Anomala corpulentaMotschulsky)成虫嗅觉相关蛋白的功能,本文以铜绿丽金龟雌成虫触角为原始材料提取总RNA,利用SMART技术构建了铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库。经测定,原始文库滴度为6.74×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为1.08×1010pfu/mL,文库重组率为98.98%。随机挑取24个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段的大小在0.5~2.0kb之间,片段平均长度为1.0kb左右。经过菌液PCR并测序筛选cDNA文库,本试验获得了两条编码气味结合蛋白的全长基因序列AcorOBP1和AcorOBP2。以上数据表明,已获得高质量的铜绿丽金龟触角全长cDNA文库,并筛选、克隆获得了气味结合蛋白基因序列。这为进一步研究触角内气味结合蛋白的功能奠定了基础。     

豌豆蚜特异性扩张分支气味受体基因的克隆及表达分析

豌豆蚜Acyrthosiphon pisum气味受体家族存在明显扩张现象,推测在豌豆蚜寄主适应过程中起着重要作用。本研究旨在克隆豌豆蚜特异性扩张分支上的气味受体基因,明确这些气味受体基因在不同组织中的表达水平。通过PCR技术克隆特异性扩张分支上气味受体基因的全长序列,采用实时荧光定量RT-qPCR技术测定这些基因在触角及足中的表达水平。克隆获得豌豆蚜特异性扩张分支中4个气味受体基因全长序列(GenBank登录号：OL739156-OL739159),分别编码374～376个氨基酸,序列相似性较高,为68.09%～83.11%,均具有7个跨膜结构域。荧光定量RT-qPCR结果显示ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在豌豆蚜成虫触角及足中均有表达,其中ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在触角中偏好表达,ApisOR13基因在触角中的表达量最高。本研究为解析豌豆蚜特异性扩张气味受体的功能提供了分子基础。     

柑橘大实蝇NPC2基因的序列分析和组织表达模式

柑橘大实蝇是柑橘上的重要害虫,主要为害柑橘果实。NPC2是一种小分子蛋白,参与了脊椎动物的脂质代谢,最近有研究表明,NPC2有着类似于昆虫气味结合蛋白的功能,参与了昆虫的化学通讯。为了明确NPC2基因在柑橘大实蝇成虫组织中的分布,本研究从柑橘大实蝇转录组中,鉴定了NPC2基因,命名为BminNPC2。通过生物信息学方法分析了该基因序列特征并构建了系统进化树,采用实时荧光定量PCR技术研究了BminNPC2基因在柑橘大实蝇成虫组织中的表达模式。结果表明:BminNPC2基因开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,等电点为6.10,分子量大小为16.66 kD,含有6个半胱氨酸。BminNPC2基因在柑橘大实蝇头部(去掉触角)和腹部表达量最高。据此结果我们在文中对BminNPC2基因功能进行了简要讨论。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因

几丁质脱乙酰基酶（CDA）在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区（47～103）,催化区（199～355）,低密度脂蛋白受体区（124～158）。序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异。苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA（GQ411189）一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA（AY966402）、蓓带夜蛾CDA（EU660852）和棉铃虫CDA（GQ411190＼GQ411191＼EF600051）氨基酸序列间的一致性只有36%~38%,属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU188855。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶,在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列,该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp,开放阅读框长度为2061 bp,编码686个氨基酸组成的多肽,分子量约76.1 ku,等电点5.68,具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明,MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近,其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高,达92%。基因表达水平研究发现,MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达,在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后,MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异,经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物细胞质内含体蛋自基因的序列分析

利用RT-PCR,获得了小麦黄花叶病毒湖北罗田分离物细胞质内含体(CI)蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,湖北罗田分离物CI基因由1977个核苷酸组成,编码一个由659个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的河南潢川、四川雅安、江苏扬州及日本分离物序列比较,不同分离物之间核苷酸序列同源性在95.0％～97.5％之间,相应推导的氨基酸序列同源性在93.2％～97.1％之间。并对CI蛋白的功能进行了讨论。