胎牛血清对猪孤雌胚早期体外发育的影响

探讨了在猪孤雌胚体外发育的第3、4、5、6天分别添加胎牛血清(FCS)对孤雌胚发育能力的影响.结果,在体外培养的第5,6天添加10%FCS组得到的囊胚率和囊胚孵化率最高,第5天添加FCS组的囊胚细胞数最多.结果表明,FCS可以促进猪孤雌胚胎的早期体外发育.     

体内、外卵母细胞对猪体细胞克隆胚胎发育潜力的影响

为探讨猪体内、外成熟卵母细胞对核移植重组胚胎发育能力的影响,试验通过激素促排获得体内成熟卵母细胞和收集废弃卵巢获取体外成熟的卵母细胞,分别构建核移植重组胚,比较其卵裂率、囊胚率及胚胎移植受孕情况。结果显示,PGC+PMSG+HCG组的平均排卵数（27.8枚/头）显著高于PGC+HCG （12.5枚/头）、PMSG+HCG （13.7枚/头）及自然发情组（11.5枚/头）（P<0.05）,体内收集到的卵母细胞,可用于构建核移植重组胚的可用卵率均达到90%以上,与其他处理组差异不显著（P>0.05）,说明通过激素处理可获得更多的可用卵母细胞,而且卵母细胞的质量没有显著差异;以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎,二者的胚胎融合率（80.31%和79.29%）和卵裂率（90.40%和86.51%）差异均不显著（P>0.05）,但来自体内成熟卵母细胞克隆的胚胎发育至囊胚期的比例显著升高（P<0.05）;将体内、外成熟卵母细胞构建的核移植重组胚分别移植代孕母猪,头平均移植30或60枚时,体内成熟卵母构建的克隆胚胎移植出生仔猪10头,而体外培养卵母细胞构建的克隆胚胎均未着床受孕,表明通过激素促排获得的卵母细胞质量更好,能显著提高克隆胚胎的囊胚率,减少胚胎移植数量,提高代孕母猪的怀孕率。     

抽提物处理供体细胞对克隆胚胎发育的影响

本研究采用爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(JBCFF),并以发生重编程的细胞为核供体进行体细胞核移植,研究其对克隆效率的影响.分别超排3只爪蟾,收集卵母细胞后提取其抽提物,用BCA蛋白浓度测定试剂盒确定其蛋白含量,SDS-PAGE分析其中所含蛋白的种类.应用细胞膜透化剂Digitonin对建立的JBCFF进行通透处理和PI染色,筛选最适浓度;并用获得的抽提物处理牛体细胞,获得重编程细胞.以发生重编程的体细胞为供体进行核移植,同时比较离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种组合激活后克隆胚的体外发育能力.结果,3个爪蟾卵母细胞抽提物样品的蛋白浓度分别为56.2255、64.6570和71.2158 μg/mL,其中所含蛋白种类一致,主要集中在40~55、70~100 ku之间.经过连续的筛选,透化剂Digitonin对JBCFF通透处理的最适浓度为7 μg/mL,PI染色显示透化效率为55.44%.爪蟾卵母细胞抽提物与体细胞共孵育后继续培养6~7 d,细胞聚集形成"克隆簇".分别以"克隆簇"细胞和未处理细胞为核供体,制备的重构胚在融合率(92.83%和96.04%)、卵裂率(89.64%和89.78%)和囊胚率(24.06%和23.12%)均无显著差异(P>0.05);离子霉素+6-DMAP和A23187+6-DMAP两种激活方式对克隆胚胎的分裂率(92.16%和92.28%)和囊胚率(23.21%和24.18%)均无显著影响(P>0.05).爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛体细胞发生重编程,并恢复到较低的分化状态,但没有显著促进克隆胚胎的体外发育,可见缺少对胚胎发育起重要作用的重编程过程,还需要继续深入研究.     

不同胎牛血清对动物细胞体外培养的影响

本研究针对血清在细胞库构建中的基础性作用,以中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的20枚京星矮脚鸡的7日龄蛋胚为试验材料,利用2 种不同的胎牛血清,采用贴壁培养方法,对细胞进行培养、传代及冻存。观察细胞原代及传代后的生长个体数、生长瓶数,细胞形态、冻存前形态及细胞生长曲线。结果表明,不同血清对细胞培养有一定的影响,血清B培养的细胞各方面都优于血清A培养的细胞。本研究结果为细胞体外培养中的血清选择提供了依据。     

供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

以中国农业大学实验用小型猪香猪胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞3种细胞系为供体细胞进行核移植。比较了血清饥饿法和接触抑制法处理胎儿成纤维细胞诱导进入G0／G1期的效率，发现二者差异不显著（P〉0．05），血清饥饿2d和4d差异不明显，同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P〉0．05）。系统研究了影响克隆胚胎发育的供体因素：血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等，结果表明：血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；圆形光滑细胞有利于细胞融合，对早期发育无显著影响（P〉0．05）；不同个体、不同类型的供体细胞对克隆胚囊胚发育率有一定的影响。     

冷冻保护剂和胎牛血清对牛成纤维细胞冷冻效果的影响

以甘油与DMSO为冷冻保护剂,添加5%-20%胎牛血清的DMEM为基础冻存液,对鲁西黄牛皮肤成纤维细胞进行冷冻保存,结果表明:①同浓度DMSO为冷冻保护剂效果优于同浓度的甘油(P<0.05),但添加50%血清时并不明显(P>0.05),可能与较高血清浓度有关,血清对冻存细胞的影响高于冷冻保护剂的作用。②血清浓度一定时,DMSO和甘油浓度在10%-15%时,冻存效果较好。③当甘油与DMSO浓度一定时,血清浓度越高冷冻保存效果越好。④甘油与DMSO浓度一定时(DMSO浓度5%除外),添加10%和20%血清效果无差异(P>0.05)。因此,在实际应用中,考虑成本等因素,血清浓度达到10%时就已经能达到一般试验要求。     

胎牛血清不同组分对昆虫杆状病毒复制的影响

为探讨胎牛血清(FBS)中的不同组分对昆虫杆状病毒(BAC)复制的影响,找到血清中能提高病毒复制效果的有效组分,对亲和凝胶层析柱法分离获得血清中的四个混合组分(S1、S2、S3和S4)进行了病毒培养实验。在6孔板上接种SF9细胞,培养24 h,接种0.01MOI的BAC-GFP病毒,按照0、0.3%、0.6%、1.3%、2.5%、5%的浓度梯度加入6孔板中进行病毒培养。分别在24 h、48h、72 h、96 h进行荧光拍照、观察。96 h收集病毒上清,进行空斑形成实验测定病毒滴度。用收集的病毒感染SF9细胞,72 h流式检测病毒的复制情况。结果显示:血清样本S1在浓度1.3%以上时,对于BAC的复制有促进作用; S2没有促进效果,反而随着S2的浓度上升而出现抑制的情况; S3在浓度2.5%以上时,同样有着明显促进作用; S4的促进作用不显著。试验表明,与原胎牛血清相比,添加单一血清组分S1对提高BAC病毒的复制效果更显著。     

不同蔗糖浓度、供体细胞保存温度和融合温度对小鼠体细胞克隆胚胎发育的影响

以昆明小鼠为实验动物,经过超数排卵后得到卵丘卵母细胞复合体(COCs),以卵丘细胞为核供体细胞,卵母细胞为核受体细胞进行核移植,分析比较了不同蔗糖浓度对小鼠卵母细胞去核时间、去核率及重构胚体外发育的影响,并探讨了供体细胞的保存温度和融合温度对重构胚体外发育的影响.结果表明,各蔗糖浓度组的去核率均达到100%,但3%、4...     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶＋0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异（P〉0.05...     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶+0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P>0.05),但明显高于其他处理组(P<0.01)。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响.试验结果表明,0.25％胰酶+0.20％Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5％与10％浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5％与10％浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P＞0.05),但明显高于其他处理组(P ＜0.01).     

TSA处理供体细胞或重构胚对山羊克隆胚胎发育的影响

本研究探讨了TSA处理供体细胞或重构胚对山羊克隆胚胎发育的影响,不处理组设为对照组.选择经5、25、50、75、100 nmol·L-1 TSA处理24 h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,结果50和75nmol·L-1组的囊胚率显著高于对照组(27.34%、26.89%VS 16.18%,P<0.05);用5、25、50、75或100 nmol·L-1TSA处理重构胚10 h,结果5、25、50、75 nmol·L-1组的囊胚率均有所提高,其中50 nmol·L-1组显著高于对照组(27.34%VS 16.53%,P<0.05).结果表明,TSA处理供体细胞和重构胚均能显著提高山羊克隆胚囊胚率,说明TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平和DNA甲基化水平,因而提高了克隆胚的发育率.     

体细胞克隆太湖猪出生

以中国太湖猪胎儿成纤维细胞为核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体,以杜洛克猪为代孕母猪,进行了太湖猪体细胞克隆技术的研究,成功地获得了首例体细胞克隆太湖猪仔猪.经微卫星DNA多态性鉴定,确定克隆猪来自供核细胞,与代孕母猪无亲缘关系.本研究将为体细胞克隆技术在我国太湖猪育种、建立人类疾病模型等研究方面提供可行的技术方法.     

猪体细胞克隆和基因编辑技术研究

<正>体细胞核移植（somaticcell nucleartransfer,SCNT）是一种将已分化的细胞重编程恢复其全能性,进而生产与供体细胞基因型完全相同后代的无性繁殖技术。包括收集并成熟卵母细胞,供体细胞核处理,重构胚的体外激活,胚胎的培养和移植等过程。猪的SCNT技术的建立在农业和医学有广泛的应用。     

提高猪胚胎发育能力和克隆效率的研究进展

体细胞克隆对猪有广阔的发展前景,但由于克隆技术操作程序复杂、成功率低(1%～2%),又限制了该技术的广泛应用。近年来,随着人们在猪的体细胞克隆相关机理、关键技术环节上研究的不断深入,克隆猪生产流程得以简化、成本降低。此外,猪体细胞克隆技术的迅速发展,为转基因猪研制提供了一种更加便捷、有效、经济的技术平台。本文综述了近年来对提高猪克隆胚胎发育能力及克隆效率所取得的进展,旨在为进一步提高猪体细胞克隆生产效率提供参考。     

丙戊酸处理对不同类型供体细胞猪手工克隆胚胎发育潜能的影响

为探讨丙戊酸(VPA)处理对不同供体细胞来源猪手工克隆(HMC)重构胚发育效果的影响,分别以猪卵巢颗粒细胞(GC)、猪胎儿成纤维细胞(PFF)和转基因猪胎儿成纤维细胞(Tr-PFF)为供体细胞,采用不同浓度(0、25、50、75、100、150nmol/L)VPA处理,观测比较不同试验组之间猪HMC重构胚发育的效果。结果显示,以GC为供体50nmol/L VPA处理组的猪HMC重构胚囊发育率达到48.92%,囊胚细胞总数为80.33个,极显著高于其他浓度组(P<0.01);以PFF为供体50、75nmol/L VPA处理组猪HMC重构胚囊胚率分别为52.82%和51.41%,极显著高于其他浓度组(P<0.01),其中50nmol/L处理组囊胚细胞总数为75.67,极显著高于其他浓度组(P<0.01);以Tr-PFF为供体100nmol/L VPA处理组的猪HMC重构胚囊胚率为42.74%,囊胚细胞总数为75.67,极显著高于其他浓度组(P<0.01)。结果表明,不同类型供体细胞对猪HMC重构胚的体外发育潜能有显著的影响,一定浓度的VPA处理可显著提高猪HMC重构胚体外发育囊胚率和细胞数,不同类型的供体细胞最佳VPA处理浓度亦有不同。     

聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白对牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的影响

为了比较不同浓度的聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)对牛卵母细胞体外成熟率、重组胚卵裂率和发育率的影响,试验采用抽吸法回收卵母细胞,用不同的无血清成熟液进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养.结果表明,适合延边黄牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的PVA、PVP和BSA的最佳浓度分别是1.0 mg/mL,0.3%和0.4%.     

胎牛血清及热处理家蚕体液对家蚕微孢子虫体外增殖的影响

对家蚕微孢子虫在体外增殖的研究表明 :培养基中胎牛血清 (FBS)添加量在 5 %～ 15 %范围内与微孢子产生量呈线性正相关关系 ;加热家蚕体液对家蚕微孢子虫体外增殖的促进作用则主要表现在与FBS的复合效应上 ,5 %FBS +5 %加热家蚕体液添加区的微孢子产生数为 10 %FBS添加区的 133 5 2 %。