雪龙黑牛试管胚胎产业化生产培养方法的建立

为充分利用雪龙兼松屠宰场废弃的优秀母牛卵巢,加速雪龙黑牛培育进程,满足高档牛肉市场需求,本文对胚胎生产体外受精3个关键技术环节进行了试验研究,共做了15批次试验,包括卵母细胞体外成熟培养的试验研究,卵母细胞体外受精试验研究以及受精卵体外培养试验研究。结果显示,卵母细胞的成熟率达98.6%,卵裂率为86.5%,囊胚发育率为36.8%。初步建立了一整套雪龙黑牛试管胚胎产业化生产培养方法和技术。     

奶牛体外受精效果几种影响因素的研究

文章研究了卵巢的保存温度、保存时间、不同的培养液成分、培养方法等对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响.结果表明①采集的卵巢在37℃保存2h时,卵巢卵母细胞体外受精后的卵裂率(71.3%)和囊胚率(31.4%),与25℃保存组的卵裂率(75%)和囊胚率(30.7%)相比,差异不显著(P＞0.05);但与40℃保存组(55%和15%)和4℃保存组(47.8%和12%)有显著差异(P＜0.05);当卵巢保存6h时,25℃保存组的卵裂率(70.2%)和囊胚率(29.2%)均显著高于37℃保存组(50.9%和13%)(P＜0.05);与40℃保存组(30%和7%)和4℃组(30.1%和8.2%)差异极显著(P＜0.01);但与保存2 h组差异不显著.在25℃温度下,屠宰牛卵巢保存时间达到8h时,卵母细胞的卵裂率和囊胚率显著下降,分别为55%和14%.②作为早期胚胎的培养液,CRlaa的效果好于TCM-199.③50μl微滴组的卵裂率(71%)与微滴100μl组(75%)和500μl组(72%)无显著差异(P＞0.05),但囊胚率(15.8%)显著低于100μl组(32%)(P＜0.05);大体积培养组(2 ml)的卵裂率和囊胚率(55%和14.8%)显著低于100μl组和500μl组(P＜0.05).     

卵巢质量和保存液对牛卵母细胞体外发育能力的研究

为研究卵巢质量和保存液对牛卵母细胞孤雌发育能力的影响,本实验将采集卵巢按其质量分为A、B 2组,于生理盐水中运输到实验室,利用切割法采集卵巢表面卵泡中的卵母细胞培养,成熟后孤雌激活;将采集牛卵巢随机分到D-PBS保存液与生理盐水中,运送到实验室后采集卵母细胞培养。以卵母细胞的成熟率、孤雌胚的卵裂率、囊胚率来评价卵巢质量、保存液对卵母细胞发育能力的影响。结果表明:A组卵巢平均获得的卵母细胞数(2.1枚)显著低于B组卵巢获得的卵母细胞数(5.5枚),从A组卵巢上获得的卵母细胞成熟率(56.98%)、卵裂率(42.86%)及囊胚率(9.52%)显著低于B组卵巢上获得的卵母细胞成熟率(84.38%)、卵裂率(70.17%)及囊胚率(31.50%)(P<0.05);使用含离子丰富的D-PBS溶液,较对照组保存液生理盐水,其卵母细胞的成熟率、卵裂率及囊胚率均没有显著差异(P>0.05)     

牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎培养的研究

以牛卵母细胞为试验材料,研究了不同温度、不同运送时间对牛卵母细胞成熟的影响,比较自配成熟培养液与IVMD101成熟培养液对牛卵母细胞发育的影响,也进行了孤雌激活和体外受精在相同培养条件下对牛卵母细胞胚胎发育的影响比较.结果表明:卵巢在37～42℃运输后的成熟率(11.3%)明显低于20～30℃、30～37℃(79.3%、85.1%),20～30℃、30～37℃组间差异不显著(P>0.05);运送6 h后的卵母细胞成熟率(53.2%)明显低于4 h内、4～6 h(85.6%、77.8%),4 h内、4～6 h组间差异不显著(P>0.05);自配成熟液与IVMD成熟液相比,体外成熟率(89.03%、88.89%)、卵裂率(71.73%、74.53%)、8细胞率(62.35%、72.05%)和囊胚率(22.94%、21.18%)均无显著差异(P0.05).     

褪黑素对猪卵巢在不同时间和温度条件下保存后卵母细胞体外成熟的影响

本研究旨在探讨不同温度和时间保存猪卵巢后对猪卵母细胞体外成熟的影响,通过培养液中添加不同浓度褪黑素,探索褪黑素对卵母细胞体成熟的最佳浓度,为远距离运输卵巢最适温度和时间条件的研究提供理论依据,进而改善胚胎体外生产效率。本实验将卵巢分别在4、17、25、37℃保温杯内保存0、4、8、10 h,筛出最适温度与时间后,在卵母细胞体外培养液中分别添加10^-5、10^-7、10^-9 mol/L浓度褪黑素,体外成熟44 h,采用孤雌激活的方式发育为胚胎,统计极体排出率、卵裂率、囊胚率。结果显示：卵巢37℃保存10 h,4℃保存4 h后卵母细胞均未达到MII期;与37℃和4℃相比,17℃、25℃保存卵巢后卵母细胞成熟质量得到大幅度提升(P<0.01);卵巢在25℃随着保存时间的延长,卵母细胞成熟率无显著差异,囊胚率高于17℃(P<0.01),且25℃保存卵巢8 h与4 h囊胚率无显著差异;25℃保存8 h后培养液中添加褪黑素,发现卵母细胞发育能力不受损伤,添加10^-7 mol/L褪黑素对卵母细胞体外发育...     

不同冷冻方法对牛卵母细胞及孤雌胚发育的影响

研究了麦管和OPS管法冷冻以及OPS法中保护剂种类对牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果发现,OPS管冷冻牛卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率极显著高于麦管法(P<0.05)。在OPS法中,应用两种保护剂冷冻后,卵母细胞形态正常率、卵裂率、囊胚率差异极显著(P<0.01);采取38℃与25℃温度平衡,冷冻后卵母细胞各发育指标差异不显著(P>0.05);采用4℃平衡,冷冻后的卵母细胞激活后没有出现囊胚,各发育指标极显著降低(P<0.01)。结果表明,OPS法可以有效地保护卵母细胞,保证其后孤雌激活;采用低温平衡会对孤雌发育的囊胚阶段有较大影响。     

屠体羊卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

为研究屠体羊卵巢保存时间对其卵母细胞体外受精发育能力的影响,将采集的卵巢随机分为3个试验组和1个对照组,在15~20℃含双抗的生理盐水中分别保存0 h、6 h、12 h、18 h进行成熟培养和体外受精。结果表明:羊屠体卵巢在15~20℃含双抗的生理盐水中,保存6 h和12 h卵母细胞成熟率(72.03%、70.87%)、卵裂率(74.12%、72.60%)、囊胚率(22.22%、20.75%)与0 h卵母细胞成熟率(73.68%)、卵裂率(74.49%)、囊胚率(23.29%)间无显性著差异(P0.05),保存18 h卵母细胞成熟率(67.39%)、卵裂率(29.35%)、囊胚率(16.30%)与0 h间差异也不显著(P0.05)。说明羊屠体卵巢在15~20℃含双抗的生理盐水中,保存6、12和18 h,不影响卵母细胞继续发育。     

体外受精不同时间等因素对体外受精效果的影响

本试验对牛体外受精不同时间、不同的培养液成分和培养方法等对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响进行了研究。试验包括:(1)牛体外受精不同时间(8h、20h)对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响;(2)不同的培养液成分对奶牛体外受精早期胚胎发育的影响。研究结果表明:(1)牛体外受精时间20h对奶牛体外受精后的卵裂率(78%)好于体外受精8h组(76%),但囊胚发育率前者不如后者好(20.51%VS23.68%),两者间差异不显著(P0.05)。(2)作为早期胚胎的培养液IVD101、TCM199培养系的卵裂率分别为76%、74%,而囊胚率却分别为22.37%、22.97%,TCM199培养系好于IVD-101,但两者间差异不显著(P0.05)。     

卵巢运输温度对猪卵母细胞体外受精和发育的影响

研究发现 ,在猪卵巢卵母细胞的体外受精和体外发育过程中 ,卵巢的运输温度对其有着重要的影响。当运输温度接近室温 (2 7± 2 )℃时 ,体外受精平均卵裂率为 5 3.0 % ,而运输温度接近体温 (36± 2 )℃时 ,平均卵裂率为 39.1% ,2组之间具有显著差异 (P <0 .0 1)。但 2组的囊胚形成率无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,分别为 7.3%和 6 .9%。当温度降为(2 0± 2 )℃时 ,平均卵裂率下降到 32 .4 % ,与室温运输具有显著差异 (P <0 .0 1) ,而与体温运输差异不显著 (P>0 .0 5 ) ,囊胚形成率 (4 .4 % )低于以上 2组 ,但统计学上无显著差异 (P >0 .0 5 )。     

影响绵羊体外受精因素的研究

本试验对影响绵羊体外受精的因素进行了分析。结果表明:在相同条件下添加和不添加VEGF(血管内皮生长因子)的卵裂率分别为81.5%、84.9%(P>0.05),但囊胚发育率分别为31.5%和22.4%,差异显著(P<0.05)。受精时间8 h和12 h对卵裂率(80.8%、83.9%;P>0.05)和囊胚发育率(28.8%、23.5%;P>0.05)没有显著影响。卵巢采回后立即切割和在25~30℃的生理盐水中保存3 h的卵裂率分别为82.9%、86.5%,囊胚发育率分别为30.4%、29.7%,差异均不显著(P>0.05)。     

热应激对植入前牛胚胎发育的影响

采集屠宰母牛卵巢和输卵管中的卵母细胞，进行体外受精，受精卵继续在体外培养。将发育3d的牛胚胎于42℃下分别培养0．5、2．0和4．0h，与对照组（39℃）牛胚胎相比，接触最高热应激（42℃，4h）处理的胚胎，约509／6的胚胎发育速度明显下降。而处理组牛胚胎发育到第9d的囊胚数、细胞数及内细胞团与滋养外胚层比率与对照组差异不显著（P〉0．05）。表明，温度升高对牛囊胚期胚胎的发育没有明显损害。对9d的囊胚进行基因性别分析发现，正常体外培养的雄胚发育快于雌胚，而在发育第3d受42℃热应激后，到囊胚期生存的胚胎性别比率发生改变，雌胚比率高于雄胚，表明雌性胚胎比雄性胚胎具有更强的抗热应激能力。     

低温长时间保存的绵羊卵巢对卵母细胞发育潜力的影响

本试验比较了绵羊卵巢不同的保存温度、时间与保存液对其卵母细胞孤雌发育能力的影响。结果表明,将绵羊卵巢在14~18℃保存15~17h,对卵母细胞的成熟率(80.9%vs82.2%)、孤雌激活后囊胚的发育率(21.0%vs22.0%)均无显著影响,采用生理盐水或D-PBS保存对卵母细胞的发育亦无显著差异;而将卵巢保存在4℃或25~30℃却显著降低了卵母细胞的成熟率(61.9%vs19%)与卵裂率(8.6%vs9.1%),没有发育到囊胚。从而得出,卵巢在14~18℃保存过夜,不影响卵母细胞的发育能力。     

猪胚胎早期卵裂时间与其发育潜能关系的初步研究

旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养,将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组(16～22 h)与晚期卵裂组(26～32 h)统计比较卵裂率和囊胚率,并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明,猪孤雌激活胚胎在16～22 h发生卵裂的为50%～60%,而26 h之后发生卵裂的不到20%,在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%,42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组(P0.05)。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组(P0.05),Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组(P0.01),Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组(P0.01),而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎(26～32 h)显著上调(P0.05)。结果显示,初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎,其囊胚多能性相关基因表达上调,凋亡相关基因表达下调,卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。     

不同浓度CO2对牛卵母细胞体外成熟和受精的影响

对牛卵巢卵泡内卵母细胞在不同浓度的CO2培养箱内体外成熟、体外受精后的卵裂率及胚胎体外发育进行了研究。结果显示,含5%小牛血清(CS)的TCM-199内的卵母细胞在2%CO2条件下培养20h后,达到第二次减数分裂期(MⅡ期)的卵子数明显高于在5%CO2条件下培养的卵母细胞数(P<0.05)。两种浓度的CO2条件下培养的牛卵母细胞体外受精后的卵裂率无明显差异,2%CO2浓度下培养的卵母细胞的囊胚发育率高于5%CO2浓度下培养的卵母细胞。     

利用体外受精技术产业化生产奶牛胚胎--长距离运送卵巢的保存温度的影响

实验 1,利用 9187枚荷斯坦母牛卵巢 ,进行 71批次的胚胎体外产业化生产 ,结果表明 ,母牛卵巢在离体后约 14 h的长时间运输保存条件下 ,控制其保存温度从最初的 30～ 35℃缓慢下降至到达实验室时的 15～ 2 0℃时胚胎体外生产效果最好 ,其卵母细胞体外受精卵裂率 (75 .6 % )、囊胚率 (2 5 .0 % )和冻胚率 (10 .0 % )均显著地高于其他各组 (10～14℃ ,2 1～ 2 8℃ ,P<0 .0 1)。实验 2 ,在相同的保存温度下 ,保存 7h的肉牛卵巢产胚效果要显著地好于保存 14 h的奶牛卵巢组。结果说明 ,在当前牛胚胎产业化生产的条件下 ,牛卵巢在收集和运输期间的保存温度变化对其后卵母细胞体外受精及胚胎体外发育有很大的影响 ;母牛卵巢在适当的温度下保存 14 h后 ,仍可获得较好的体外产胚效果     

牛胚胎体外生产技术的简化研究

利用屠宰牛卵巢分离的卵母细胞，以卵裂率和囊胚发育率为标准，对牛胚胎体外生产过程进行了简化试验。结果显示：不加卵丘细胞的高密度卵母细胞体外成熟（１００￣２００枚／平皿）可代替加卵丘细胞的标准密度（５０枚／平皿）培养，其卵裂率（５７．６％比６２．５％）和囊胚发育率（２３．７％比２９．１％）没有显著差异（Ｐ〉０．０５），体外授精时间可从成熟培养后２２ｈ延长至２７ｈ，卵裂率和囊胚发育率均没有显著变化，卵母     

体外受精温度、时间及卵子质量对延边黄牛受精卵体外发育的影响

本研究探讨了体外受精温度、时间及卵子质量对延边黄牛卵母细胞体外受精后体外发育的影响。试验结果表明，体外受精温度为39℃、体外受精时间12h时，卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率最佳；卵子的质量对受精卵体外发育的影响很大。     

雪龙黑牛活体采卵与屠宰采卵在体外受精技术中的应用研究

利用超声波活体采卵技术(ovum pick-up,OPU)对12头纯种雪龙黑牛间隔4d采卵2次,对51头F2代遗传性能优秀的雪龙黑牛每周采卵1次,并对活体采卵与屠宰采卵及体外受精后胚胎的发育进行了对比分析.结果表明,活体采卵第2次卵泡数比第1次多82个,而获得的卵母细胞数第2次比第1次少1 2枚;屠宰采卵优秀卵母细胞率高于活体采卵,并且囊胚发育率高于活体采卵.     

猪胚胎早期卵裂时间与其发育潜能关系的初步研究

旨在探讨初次卵裂时间对猪孤雌胚胎发育潜能及其基因相对表达水平的影响。本试验从健康母猪卵巢上抽取卵母细胞进行体外成熟培养，将猪孤雌激活胚胎分为早期卵裂组（16~22 h）与晚期卵裂组（26~32 h）统计比较卵裂率和囊胚率，并对囊胚的多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4等和凋亡相关基因Bcl-xl、Bax、Caspase-3的相对表达水平进行分析检测。结果表明，猪孤雌激活胚胎在16~22 h发生卵裂的为50%~60%，而26 h之后发生卵裂的不到20%，在18 h前完成第一次卵裂的胚胎囊胚发育率为79%，42 h后发生初次卵裂的胚胎无法发育至囊胚期。猪孤雌激活胚胎早期卵裂组的囊胚发育率显著高于晚期卵裂组（P<0.05）。早期卵裂组囊胚的Oct4、Nanog、Sox2、Klf4基因的表达量显著高于晚期卵裂组（P<0.05），Oct4、Sox2、Klf4基因的相对表达量极显著高于晚期卵裂组（P<0.01），Bax和Caspase-3基因的相对表达水平极显著低于晚期卵裂组（P<0.01），而Bcl-xl作为保护因子其表达量相对于晚期卵裂胚胎（26~32 h）显著上调（P<0.05）。结果显示，初次卵裂时间较早的猪孤雌激活胚胎发育潜能显著高于较晚卵裂胚胎，其囊胚多能性相关基因表达上调，凋亡相关基因表达下调，卵裂时间可作为鉴定猪孤雌激活胚胎发育潜力的重要参数。     

核移植前激活受体卵子对牛核移植卵体外发育的影响

本研究探讨了核移植前对受体卵子进行激活、细胞融合开始时间及供体受精卵细胞周期调节对核移植卵体外发育的影响。其结果显示核移植前对受体卵子激活组的细胞融合率与对照组没有差异 ,但重组胚胎的卵裂率、8～ 16细胞期胚胎及囊胚的发育率比对照组明显提高 ;核移植前激活的受体卵子分别在卵子体外成熟开始的第30h和 4 5h与供体细胞进行细胞融合 ,结果 ,30h组的细胞融合率和卵裂率与 4 5h组没有差异 ,但发育到 8～ 16细胞期及囊胚的发育率均比 4 5h的高 ;将供体受精卵用诺考达唑 (Nocodazole)处理后 ,进行核移植的结果 ,处理组的细胞融合率、卵裂率、发育到 8～ 16细胞期和囊胚的发育率与对照组无差异