中华蜜蜂GABARAP基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体的构建

[目的] 对中华蜜蜂（Apis cerana cerana）中自噬相关蛋白Atg8家族成员γ-氨基丁酸相关受体蛋白（gamma-aminobutyric acid receptor type associated protein,GABARAP）基因进行克隆鉴定和生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行原核表达,以期为后续探究该基因的功能奠定基础。[方法] 根据GenBank中西方蜜蜂（Apis mellifera）GABARAP基因序列（登录号：XM_001120069.5）设计引物,采用巢式PCR对中华蜜蜂GABARAP基因进行扩增、克隆;运用生物信息学软件对其氨基酸序列相似性、二级结构、三级结构进行比对和预测分析;构建GABARAP基因原核表达载体,利用Western blotting对GABARAP蛋白进行鉴定后并用IPTG诱导纯化。[结果] 经巢式PCR扩增得到中华蜜蜂GABARAP基因序列;使用在线BLAST工具对氨基酸相似性进行分析显示,中华蜜蜂GABARAP与西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、欧洲熊蜂、东方熊蜂的氨基酸序列相似性为100%;氨基酸序列系统进化树显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂亲缘关系最近,与秀丽隐杆线虫亲缘关系最远。生物信息学分析结果显示,GABARAP基因编码区全长354 bp,编码117个氨基酸,蛋白分子质量为13.99 ku,理论等电点为9.48;GABARAP蛋白二级结构主要由3个α-螺旋、4个β-折叠和6个多肽结合位点构成,二、三级结构预测结果一致;SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导的GABARAP蛋白分子质量为35 ku;Western blotting鉴定结果证明了His单克隆抗体可以特异性识别GABARAP蛋白。[结论] 本研究成功克隆了中华蜜蜂GABARAP基因,获得了GABARAP蛋白并进行了生物信息学分析,为进一步研究GABARAP基因及其蛋白在自噬发生中的作用提供了参考。     

猪伪狂犬病病毒SL株TK基因的克隆与生物信息学分析

本试验对伪狂犬病病毒SL株(四川分离株)TK基因进行克隆,并对TK基因的同源性、遗传进化树、密码子偏嗜性、氨基酸结构及亲疏水性、跨膜区、信号肽进行了分析。结果显示,本研究成功克隆了PRV SL株TK全基因,其编码区长963 bp,编码320个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性超过99.3%,编码的多肽链中疏水区域大于亲水区域,不含跨膜区及信号肽,不存在于病毒囊膜。     

意大利蜜蜂细胞色素C基因的克隆鉴定

文章对意大利蜜蜂细胞色素C (Cytc)基因进行克隆、测序及生物信息学分析,为进一步的研究打下理论基础。利用PCR技术对Cytc基因进行扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增引物的特异性,切胶回收目的片段,连接p MD-19T载体,转化大肠杆菌DH5α,选取阳性的菌液进行Sanger测序。利用生物信息学分析蛋白特性。结果表明,PCR技术成功扩增出了单一且清晰的Cytc条带,并成功完成克隆和测序,证明Cytc在意大利蜜蜂中真实存在。生物信息学分析显示意大利蜜蜂Cytc分子式为C537H844N144O154S4,氨基酸数量为108个,蛋白的相对分子质量为119 09.72 Da,理论等电点为9.50,带负电的残基总数（Asp+Glu） 10个,带正电的残基总数（Arg+Lys） 18个,不稳定指数为25.33,为稳定蛋白,所编码的氨基酸也不在跨膜区。研究结果可以为进一步研究意大利蜜蜂Cytc基因的功能提供重要参考。     

草鱼CD40基因编码区分子序列特征分析

为了研究CD40基因在草鱼出血病中的作用,笔者利用生物信息学分析方法对草鱼CD40基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、蛋白质二级结构、N-糖基化位点、信号肽、结构域等高级结构进行了预测。结果表明,草鱼CD40基因编码288个氨基酸残基,是一不稳定的可溶性蛋白;有2个潜在的N-糖基化位点、存在1个典型的跨膜螺旋区;编码蛋白质的二级结构是以无规则卷曲和β-折叠为主的混合型蛋白。     

家兔Corin蛋白的生物信息学分析

应用生物信息学工具分析家兔Corin蛋白质序列,包括理化性质分析、疏水性分析、跨膜区分析、Coil区分析、亚细胞定位以及空间结构的预测。家兔的Corin基因CDS编码1 011个氨基酸残基,分子质量112 425D,其N端有一个典型的疏水性区域,17-39位氨基酸之间形成一个典型的跨膜区,无卷曲螺旋,二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、β-折叠组成,Corin蛋白的三级结构是基于丝氨酸蛋白酶(Serineprotease hepsin)结构lz8g.1的A链建模的。     

副猪嗜血杆菌OMP5 基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank 上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5 基因的核苷酸序列,设计1 对特异性引物,对贵州省HPS 分离株OMP5 基因进行扩增。结果表明所扩增的OMP5 基因的长度为1116 bp,与SH0165 株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为100%。生物信息学分析结果表明,OMP5 基因所编码的外膜蛋白P5 的理论等电点pI为9.34,不稳定系数为20.44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83.94,总体平均亲水性为-0.172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21 个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22 个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。     

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5基因的核苷酸序列,设计1对特异性引物,对贵州省HPS分离株OMP5基因进行扩增。结果表明所扩增的OIvIP5基因的长度为1116bp,与SH0165株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为lOO％。生物信息学分析结果表明,OMP5基因所编码的外膜蛋白P5的理论等电点pl为9．34不稳定系数为20．44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83．94,总体平均亲水性为-0．172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。     

猪Toll样受体5基因cDNA克隆、蛋白质序列分析及其意义

为了解猪Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系,本研究从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体5基因的cDNA序列。序列全长2641bp,其中2571bp的开放阅读框编码856个氨基酸残基的猪TLR5,含17.4%的亮氨酸,并有一段19个氨基酸的信号肽序列;同源性分析结果显示,TLR5在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、山羊、绵羊、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为77.5%、79.6%、78.3%、81.0%、69.2%和68.9%。蛋白分子结构预测结果表明,该分子由胞外区(642个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(191个氨基酸)组成,胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征。表明猪TLR5分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

瘦蛋白及其在养猪业上的研究进展

瘦蛋白 (Leptin)是脂肪细胞分泌的一种调节体脂沉积的重要因子 ,由 1 67个氨基酸残基组成 ,其中N端 2 1个氨基酸残基为信号肽 ,成熟瘦蛋白为 1 46个氨基酸残基组成的无糖化的多肽 ,相对分子量为 1 6kDa ,其中mRNA长 4 5kb。Leptin为单链 ,链内的两个半胱氨酸构成一个二硫键 ,这种结构也常见于其他分泌型多肽。就氨基酸序列分析 ,Leptin是一种球型分子 ,无明显的结构域或跨膜区 ,以单体形式存在 ,是由肥胖基因 (Obesegene ,简称ob基因 )编码的 ,其表达具有组织特异性 (Dennis等 ,1 997) ,表达部位主要在脂肪组织。Leptin作用于下丘脑的…     

猪伪狂犬病病毒受体nectin-2基因的克隆与分子特征

为了进一步了解猪nectin-2基因的结构与功能,本研究采用生物信息学结合RT-PCR的方法从猪脑组织中克隆到了猪nectin-2基因,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析.猪nectin-2基因的编码区含有1440个核苷酸,编码479个氨基酸,其中信号肽由32个氨基酸组成,胞外域由330个氨基酸组成,含有2个潜在的N-糖基化位点和6个半胱氨酸残基,跨膜区由23个氨基酸组成,胞浆区由94个氨基酸组成,猪nectin-2基因与犬、马、家鼠、人、恒河猴、牛、黑猩猩的nectin-2基因核苷酸序列同源性分别为85.4%、85.7%、78.6%、82.1%、82.1%、81.9%和82.1%;推导氨基酸序列的同源性分别为84.5%、83.0%、74.7%、75.7%、76.4%、78.4%和75.5%.本试验为进一步深入研究猪伪狂犬病病毒与宿主之间的关系奠定了基础.     

中华蜜蜂Takeout(AcTO1)基因的克隆和表达分析

Takeou(tTO)是一种昆虫节律性调控输出基因,广泛分布于涉及到化学感受和营养功能的相关组织。TO基因主要参与昆虫的生长发育、行为调节及多种生理代谢过程。为探究TO基因是否参与社会性昆虫的劳动分工,我们克隆并分析了中华蜜蜂ApisceranaTO基因的编码框序列,测定了该基因在哺育蜂和采集蜂各个组织部位的mRNA表达水平,旨在为深入研究该基因的功能提供参考。本研究通过RT-PCR的方法首次克隆获得AcTO1基因的cDNA序列,利用生物信息学软件分析了该基因的核苷酸序列和氨基酸序列,并利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测了该基因在中华蜜蜂3种采集蜂(18日龄正常采集蜂、22日龄正常采集蜂和7日龄提前采集蜂)和2种哺育蜂(7日龄正常哺育蜂和22日龄超龄哺育蜂)头部、胸部和腹部的表达量。本研究克隆获得的中华蜜蜂TO(命名为AcTO1)基因的cDNA序列长度为1058bp,开放阅读框(ORF)长度为738bp,编码246个氨基酸,预测蛋白分子量为27.09kDa,理论等电点为8.40。AcTO1蛋白的信号肽位于1-17位氨基酸,无跨膜结构,属于分泌型蛋白。AcTO1的氨基酸序列种含有一个JHBP超家族保守结构域。qPCR结果显示,AcTO1在3种采集蜂和2种哺育蜂的各组织均有表达,其中表达量由高到低依次为头部、胸部、腹部。AcTO1基因的表达具有组织依赖型,主要表达于头部,且所有采集蜂的头部表达量均高于哺育蜂,由此说明该基因可能参与蜜蜂的劳动分工。本研究克隆了中华蜜蜂takeout基因的全长cDNA序列,并分析了该基因的序列特征和表达谱,结果表明该基因可能参与调控蜜蜂的劳动分工。     

牛GUCY1A3和SFXN1基因的克隆及生物信息学分析

试验以人GUCY1A3和SFXN1基因序列为探针,BLAST获得同源性较高的牛的表达序列标签（ESTs）序列及部分mRNA序列。通过RT-PCR方法从牛肌肉及脑组织克隆cDNA序列与牛表达序列标签进行拼接,获得牛GUCY1A3和SFXN1基因,并对其进行了生物学特性分析。序列分析表明,牛GUCY1A3基因编码区长2 076 bp,编码691个氨基酸;牛SFXN1基因编码区长969 bp,编码322个氨基酸。氨基酸序列分析表明,GUCY1A3蛋白磷酸化位点分布于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上,主要分布在细胞质中,不属于分泌蛋白,二级结构预测以α螺旋为主,保守结构域含1个CYCc功能结构域;SFXN1蛋白磷酸化位点分布于丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和苏氨酸（Thr）残基上,主要分布在内质网和浆膜上,属于跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,保守结构域含1段低复杂度序列和3段跨膜螺旋区。试验结果为进一步研究牛GUCY1A3和SFXN1基因的表达调控机制与功能奠定了基础。     

白毛乌骨鸡ChIFN-β基因克隆与生物信息学分析

为研究白毛乌骨鸡β干扰素的生物学特性,利用RT-PCR技术扩增了白毛乌骨鸡肝脏β干扰素(ChIFN-β)基因,将其连接到pGEM-T Easy载体上进行转化,重组质粒PCR鉴定后进行序列测定,同时利用BLAST、SignalP 4.1 Server、TMHMM Server v.2.0和DNAStar等软件对ChIFN-β进行生物信息学分析。结果表明:ChIFN-β基因编码区长度为612 bp,编码203个氨基酸,分子量为23.686 ku,等电点为10.3;ChIFN-β与已报道的其它鸡的IFN-β氨基酸序列具有较高的同源性;白毛乌骨鸡ChIFN-β氨基酸序列和绿头鸭首先聚类,与其它动物的亲缘关系较远;ChIFN-β存在跨膜结构,为分泌蛋白,前26个氨基酸为信号肽序列;ChIFN-β蛋白具有干扰素αβ的匹配区域,同时含有干扰素αβ受体复合物两个跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测ChIFN-β蛋白属于IFαβ超家族。研究结果为白毛乌骨鸡ChIFN-β基因的结构和功能研究提供了参考。     

马鹿β-防御素-1cDNA全长克隆、序列信息及表达分析

为了研究马鹿β-防御素-1(Red deerβ-defensin-1,redBD-1)基因的结构与功能,揭示该基因的组织表达规律。本研究利用PCR结合RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术从马鹿舌黏膜中克隆redBD-1基因的cDNA全长序列并对其进行了生物信息学分析,同时采用Real-time quantitative PCR(RT-qPCR)技术检测该基因在各组织的表达情况。结果表明,redBD-1基因的cDNA全长序列为455bp,开放阅读框(ORF)为192bp,编码64个氨基酸。生物信息学分析表明,redBD-1蛋白的理论分子量为6.94ku,有10个带正电荷的氨基酸残基,无带负电荷的氨基酸残基,理论等电点为10.85。预测redBD-1蛋白有一个分泌信号肽结构,无跨膜区,主要在细胞外发挥生理功能;6个保守的半胱氨酸残基分别以Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6连接形成3个分子内二硫键;成熟蛋白的三级结构是由β-折叠、延伸和无规则卷曲构成。redBD-1基因编码的氨基酸序列同源性最高的是梅花鹿β-防御素(siBD-1)为98.4%,其次是水牛肠β-防御素(BEBD)为92.2%,与人β-防御素-2(HBD-2)同源性最低仅为35.9%。RT-qPCR结果得出,redBD-1在被检器官中均有表达,在消化系统、呼吸系统以及生殖系统的大部分器官表达量较高,肝、肾和脾等实质性器官表达量相对较低。本试验为今后深入研究防御素基因功能以及马鹿黏膜免疫系统提供理论依据。     

西藏牦牛ATGL基因克隆及生物信息学分析

为了研究西藏牦牛ATGL基因的理化特性及分子结构,试验采用PCR扩增和DNA测序技术以及生物信息学分析软件对西藏类乌齐牦牛ATGL基因进行克隆测序和生物信息学分析。结果表明:西藏类乌齐牦牛ATGL基因编码区全长为1 461 bp,可编码486个氨基酸,其中A、T、G、C碱基含量分别为17.2%、17.9%29.0%、35.9%,A+T为35.1%,G+C为64.9%;相对分子质量为53 417.9,理论等电点为6.83,在构成该蛋白所编码的氨基酸中亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)的含量最高,分别为13.4%和9.5%,总的带正电(Arg+Lys)和负电(Asp+Glu)残基分别为46和47;西藏类乌齐牦牛ATGL基因编码区核苷酸序列与普通牛、野猪、人、绵羊、山羊、绿头鸭、原鸡、小家鼠的核酸序列一致性分别为99.58%、87.52%、87.78%、96.26%、95.93%、67.63%、64.44%、82.65%;西藏类乌齐牦牛ATGL基因编码氨基酸序列与普通牛、野猪、人、绵羊、山羊、绿头鸭、原鸡、小家鼠的氨基酸序列一致性分别为99.79%、87.45%、87.66%、95.06%、96.09%、73.14%、69.56%、87.53%;ATGL蛋白为不稳定的跨膜蛋白,无信号肽;其二级结构主要以α-螺旋、β-折叠以及无规卷曲为主,其中94个氨基酸残基参与了16个α-螺旋的形成(占39.11%),35个氨基酸残基参与了9个β-折叠的形成;在三级结构中,其N端存在1个Patatin结构域。说明西藏牦牛ATGL基因在编码区序列存在明显的碱基偏倚性,在进化关系上ATGL基因无论核苷酸序列还是氨基酸序列都有较高的保守性。     

猪细小病毒(PPV)SC1株非结构蛋白NS_1基因的克隆和序列分析

本文根据GenBank中PPV NADL-2株病毒基因组序列用Oligo6.0设计了一对引物,以抽提的PPV-SC1 RF-DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.2 kb的片段,将其插入克隆载体质粒pMD 18-T的EcoRV酶切位点处,构建了重组质粒pPNS1并测序。密码子偏向性分析结果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,主要是以A结尾的密码子;用Bioedit和swiss TMPRED软件预测PPV-SC1 NS1的跨膜区,并没有得到有显著意义的跨膜区的存在;根据基于motif数据库的结构域预测,PPV-SC1 NS1的第393~415位氨基酸残基存在潜在的ATP/GTP结合位点,该蛋白还存在16个蛋白激酶磷酸化位点,21个酪蛋白激酶2磷酸化位点,3个cAMP-/cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点,PPV-SC1 NS1蛋白与POX-D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守结构域,推测NS1可能与POX-D5有类似的功能。     

中华蜜蜂DnaJB6的生物信息学分析与功能预测

Dna JB6是重要的辅助伴侣分子,与多聚谷氨酰胺疾病、亨廷顿舞蹈症等多种人类重大疾病的发生密切相关。以往的研究不仅解析了人Dna JB6的结构,而且揭示了它在疾病发生中的作用。但是,作为热激蛋白家族的成员之一,在其他物种中的结构及功能却少有报道。旨在利用生物信息学软件分析中华蜜蜂Dna JB6的理化性质、保守结构域、跨膜结构、亚细胞定位、信号序列、修饰位点、亲缘关系、高级结构和互作蛋白。理化性质分析显示:Dna JB6由327个氨基酸残基组成带正电的不稳定亲水蛋白;结构域分析结果表明:Dna JB6具有保守的J结构域,但是没有跨膜结构域;亚细胞定位和信号序列分析发现:它由核定位信号序列介导定位于细胞核,同时,修饰位点预测显示Dna JB6一共有15个糖基化和49个磷酸化修饰位点;预测的二级结构主要为α螺旋、β折叠和无规卷曲;构建的系统进化树显示:蜜蜂属的中华蜜蜂Dna JB6与熊蜂属进化关系较近;蛋白质互作分析发现:Dna JB6与多个热激蛋白相互作用,特别是Hsp70家族的蛋白。可为进一步研究中华蜜蜂Dna JB6的结构与功能提供理论依据。     

猪伪狂犬病病毒受体nectin-2基因的克隆与分子特征

为了进一步了解猪nectin-2基因的结构与功能,本研究采用生物信息学结合RT-PCR的方法从猪脑组织中克隆到了猪nectin-2基因,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪nectin-2基因的编码区含有1440个核苷酸,编码479个氨基酸,其中信号肽由32个氨基酸组成,胞外域由330个氨基酸组成,含有2个潜在的N-糖基化位点和6个半胱氨酸残基,跨膜区由23个氨基酸组成,胞浆区由94个氨基酸组成,猪nectin-2基因与犬、马、家鼠、人、恒河猴、牛、黑猩猩的nectin-2基因核苷酸序列同源性分别为85.4%、85.7%、78.6%、82.1%、82.1%、81.9%和82.1%;推导氨基酸序列的同源性分别为84.5%、83.0%、74.7%、75.7%、76.4%、78.4%和75.5%。本试验为进一步深入研究猪伪狂犬病病毒与宿主之间的关系奠定了基础。     

绵羊Txl-2基因CDS区克隆及其生物信息学分析

本研究以绵羊睾丸组织为材料,利用RT-PCR技术获得绵羊硫氧还蛋白类蛋白2(Thioredoxin like protein 2,Txl-2)基因的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆得到的绵羊Txl-2基因CDS区为795 bp,编码264个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Txl-2编码的蛋白无跨膜区、信号肽和N-糖基化位点,存在多个磷酸化位点;预测出了Txl-2蛋白的二级结构和三级结构;Clustel W方法对比绵羊Txl-2与绵羊、山羊预测序列同源性最高。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B的生物信息学分析

为详细了解口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)非结构蛋白3B的基本结构与功能,试验采用生物信息学方法研究了非结构蛋白3B的一般理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、潜在的抗原表位,并对该蛋白进行了多重序列比对。结果表明:在NCBI数据库中检索到39个中国上传的口蹄疫病毒非结构蛋白3B序列,其中从新疆地区获得的分离株1株(Akesu/58),属于O型毒株,非结构蛋白3B具有71个氨基酸,分子式为C_(356)H_(596)N_(98)O_(93)S_1,相对分子质量为7 769.31,等电点为10.11,带负电荷氨基酸残基总数为6个,带正电荷氨基酸残基总数为16个,不稳定指数为28.67;亲水性平均系数为-0.731,无跨膜区,无信号肽;无糖基化位点,该蛋白在氨基酸序列第26位和第50位各存在1个酪氨酸磷酸化位点;二级结构延伸链占所有氨基酸比例的23.94%,β-折叠占所有氨基酸比例的4.23%,无规则卷曲占所有氨基酸比例的71.83%;三级结构蛋白覆盖率只有28%,可信度为10%;非结构蛋白3B有3个抗原决定簇,具有6个优势的B细胞抗原表位,4个优势的CD_8~+抗原表位,1个强结合多肽段和14个弱结合多肽段的CD_4~+抗原表位;非结构蛋白3B与NCBI公布的中国O型、A型和Asia 1型血清型核苷酸序列同源性分别为94.24%、91.55%和97.48%,氨基酸序列同源性分别为97.29%、92.96%、98.49%。说明非结构蛋白3B基因编码的蛋白质为亲水性蛋白,结构较为松散,同源性高,且具有保守的抗原决定簇,可作为区分疫苗接种和自然感染抗体诊断方法的候选蛋白靶标。