云南黑山羊性别决定基因体外扩增研究

对云南黑山羊 (10♂ ,2♀ )的基因组DNA性别决定基因 (SRY)进行了体外PCR扩增的研究 ,结果表明适当引物可特异性扩增出雄性个体的性别决定基因片段 (大小约为 185bp) ,而对雌性个体则不能扩增出任何片段 ;研究还利用已筛选出的性别决定基因特异性引物对少量的胚胎细胞进行了特异性扩增 ,检测了 2 0枚云南黑山羊的胚胎 ,其中有 5枚胚胎可扩增出约为 185bp的特异性片段。以上结果为山羊胚胎早期性别鉴定奠定了技术基础。     

基于SSR的羊捻转血矛线虫病的分子鉴定及PCR检测方法的建立

为能快速灵敏的检测羊捻转血矛线虫病,试验采用微卫星DNA分子标记对羊捻转血矛线虫进行二重PCR扩增。对反应条件和体系的优化,筛选出2组可用以鉴定羊捻转血矛线虫的微卫星DNA组合。结果表明:PCR条带清晰、与预期片段大小吻合。试验建立了快速准确识别羊捻转血矛线虫的分子鉴定方法,为羊捻转血矛线虫病的快速检测和诊断提供依据。     

鸭茅单拷贝核基因RPB1引物设计及筛选

通过Beacon Designer v.8和Primers Blast软件设计引物,使用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选出目的基因片段,对目的片段序列进行Blast比对,筛选出适合于鸭茅(L.)RPB1引物序列。试验结果显示:设计的10对引物中有2对引物扩增条带唯一且清晰,扩增产物经比对后验证其为目的基因。筛选出的RPB1引物对鸭茅物种起源进化及种质资源利用的研究具有重要的意义。     

关中奶山羊PIS区域序列多态性分析

山羊无角性状是畜牧业生产中重要的经济性状,报道显示山羊无角间性综合征（polled intersex syndrome,PIS）控制着山羊的无角和间性性状。山羊PIS序列定位于1号染色体约11.7 kb的序列上,试验旨在研究这段序列对关中奶山羊（3只有角山羊、3只无角山羊）无角性状的影响。选用4对引物（PIS1-1、PIS1-2、PIS2、PIS3）扩增关中奶山羊的PIS序列,第5对引物（PIS whole）用于检测PIS序列的完全缺失,对测序结果进行拼接、多态性分析,并对序列进行基因注释。结果发现,试验成功扩增出山羊PIS的全长序列（12.814 kb）,BLAST比对结果正确。PIS whole引物没有扩增出任何条带,说明关中奶山羊中不存在11.7 kb的完全缺失。经SeqMan软件分析拼接序列发现30个多态性位点,这些多态性位点可能与关中奶山羊有角/无角性状相关。对拼接序列进行基因注释,发现存在1个tRNA编码位点、2个微卫星、3个microRNA编码位点及L1-EN、RT-nLTR-like样保守结构域,并发现1个CpG岛、1对反向重复序列和2段串联重复序列。本试验结果对关中奶山羊无角性状的分子机理研究具有重要的参考价值。     

鹈鹕性别鉴定的分子标记方法

鹈鹕是一种雌雄同态鸟类,外观上难以区分。从鹈鹕血液中提取基因组DNA,参照近缘鸟类性染色体上的CHD基因和EE0.6序列,筛选了3对引物进行特异性扩增,其中2对引物组合成1个组(A/B)进行双重PCR扩增。结果表明,2组引物在雄性个体中均扩增出1条片段,在雌性中扩增出2条片段;待测群体中雄性个体2只,雌性个体8只。本试验首次确立了利用PCR技术对鹈鹕性别进行鉴定的分子标记方法。     

基于tlh和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法

为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊传染性脓疱病毒GeneBank基因序列,设计合成一对引物。通过对PCR反应条件的优化,敏感性及特异性试验,成功建立了用于检测羊传染性脓疱病毒DNA的PCR检测方法。该方法成功扩增出390 bp的目的基因片段,敏感性试验证明可以检测出320×10~(-2)ng/L的DNA。特异性试验羊痘病毒、山羊关节炎脑炎病毒均未扩增出相应片段。重复性试验对3份羊传染性脓疱病毒阳性病料进行检测,结果均为阳性。临床应用对临床送检的16份疑似羊传染性脓疱病毒感染病料用上述建立优化的PCR方法进行检测,结果显示,9份为阳性,阳性样品的PCR扩增产物克隆后进行序列分析显示均为羊传染性脓疱病毒。证明该方法具有良好的敏感性和特异性,可以用于临床诊断。     

猪圆环病毒病PCR检测方法的建立与应用

根据猪圆环病毒2型(PCV_2)基因(Rep基因)保守序列设计1对引物P1和P2,扩增700 bp的目的片段,该方法对猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒均成阴性,但可以特异地检测出PCV_2;本法能检测出1.80 ng/μL圆环病毒的DNA。对扩增目的片段测序,结果显示,扩增片段属于PCV_2。应用本方法对14份临床样本进行检测,结果表明,阳性样本为6份。本研究结果表明,本试验建立的PCR方法检测PCV_2具有较好的敏感性和特异性,可用于PCV_2感染疑似病例的诊断及分子流行病学调查。     

套式PCR检测马巴贝斯虫

根据GenBank中马巴贝斯虫(Babesia equi)ema-1基因序列,设计合成内外2对引物,其中外引物扩增ema-1基因60～627nt间567 bp片段,内引物扩增ema-1基因259～488nt间229bp片段。从实验室感染马巴贝斯虫阳性马匹全血样本中提取DNA,采取2次扩增的方法,扩增到229bp特异性条带,建立了适合马巴贝斯虫快速检测的套式PCR方法。经重复性试验和特异性试验,结果显示,马巴贝斯虫阳性样本在229bp均出现条带,而驽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫扩增结果为阴性。采用该方法对已知阴、阳性的16份马匹全血样品进行检测,有8份为阳性,与实际结果的符合率为100%。表明,所建立的方法具有较高的重复性和特异性,可用于马巴贝斯虫病的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查。     

东方蜜蜂DNA随机扩增多态及其遗传分化研究

本研究对云南及马来西亚的37个东方蜜蜂样本进行随机增多态DNA分析，从20个引物中筛选出11个引物，其中9个引物扩增出多态带。共检测到66条扩增片段，其中56条为多态带。用UPGMA聚类方法构建的分子系统树显示，云南的样本、马来西亚的样本各自分别聚在一起，说明两个样本间遗传差异较大，群体之间存在着遗传分化。但就云南的32个个体而言，虽然聚类图中大多数采用自同一地区的样本聚在一起，但也存在一定交叉，提示云南地理群体间近期可能存在一定的基因流。     

火烈鸟性别鉴定的分子标记方法

由于火烈鸟在外观上雌雄极为相似,很难用常规方法对其性别进行鉴定。本试验首次确立了利用PCR技术对火烈鸟性别进行鉴定的分子标记方法。从火烈鸟血液中提取总基因组DNA,针对性染色体上的CHD基因和EE0.6序列,筛选了4对引物进行特异性扩增,其中3对引物组合成2个组(A/B和B/C)进行多重PCR。结果表明,3组引物都在雄性个体中扩增出1条片段,在雌性中扩增出2条片段;待测群体中雄性个体11只,雌性个体6只。经检验,利用3组引物都能准确鉴定火烈鸟性别,为该物种在分子水平上的性别鉴定奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌巢式PCR检测方法的建立

为建立一种更加准确、敏感的鸭疫里默氏杆菌检测方法,根据鸭疫里默氏杆菌16S rRNA基因序列设计2对巢式PCR引物,在完成最佳反应条件筛选、特异性、敏感性、重复性试验的基础上,建立巢式PCR检测方法.结果表明,建立的巢式PCR对1、2、10、X型鸭疫里默氏杆菌的16S rRNA都能扩增出特异性片段,而对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门菌、鸭源金黄色葡萄球菌的基因组不能扩增出特异性片段,DNA最小检测量为0.392 fg/μL,是常规PCR的1 000倍.该巢式PCR方法具有快速、敏感、特异、通用的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定.     

鸭疫里氏杆菌PCR快速检测方法的建立

本试验根据GenBank中的鸭疫里氏杆菌主要外膜蛋白A基因序列,在其保守区设计了1对引物,建立了检测鸭疫里氏杆菌的PCR方法,对鸭疫里氏杆菌进行检测,结果能扩增出预期片段,而金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。说明该PCR法具有较好的特异性,可用于鸭疫里氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

鸭茅叶绿体引物筛选

为筛选适用于鸭茅物种的基因引物序列,开展相关系统发育学研究,通过搜集鸭茅近缘物种叶绿体基因引物,使用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选出目的基因片段,对目的基因进行BLAST序列比对。结果表明:试验搜集的35对引物中共能筛选出trnL-F 1、 trnL-增产物经测序及比对结果后验证均为目的基因。本研究筛选的7对叶绿体基因引物扩增效果较好,适用于鸭茅的系统发育分析。     

快速鉴别诊断山羊痘病毒和羊口疮病毒二联PCR方法的建立

参照GenBmk已发表的山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORF)的核苷酸序列设计了两对引物,建立了一种可以快速鉴别山羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR方法,检测结果显示,对山羊痘病毒和羊口疮病毒可以分别扩增出413 bp和595 bp的特异性片段,经敏感性测定,最低能检测到4 pg的DNA。对广西的送检的山羊病料20份进行检测,其中7份可扩增出413 bp的山羊痘特异片段、1份可扩增出595 bp的羊口疮特异片段。该方法能在4 h内完成整个检测过程,不仅快速,而且特异强、敏感性高,很适合于快速诊断。     

猪附红细胞体巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立一种更加准确、敏感的猪附红细胞体检测方法,本试验根据猪附红细胞体特异的DNA序列(AJ504999)设计2对巢式PCR引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该检测方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR对猪附红细胞体基因组DNA能扩增出特异性片段,而对弓形虫、链球菌、牛瑟氏泰勒虫、牛附红细胞体基因组DNA扩增反应结果均为阴性;DNA最低检测量为0.124 fg/μL;通过对55份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR的阳性检出率高23.7%。本试验为猪附红细胞体病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

鸭茅叶绿体引物筛选

为筛选适用于鸭茅物种的基因引物序列,开展相关系统发育学研究,通过搜集鸭茅近缘物种叶绿体基因引物,使用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳检测来筛选出目的基因片段,对目的基因进行BLAST序列比对.结果表明:试验搜集的35对引物中共能筛选出trnL-F 1、trnL-F 5、rpL162、rpL164、matK 6、matK ...     

RAPD标记与四川黑山羊表型性状的相关性研究

利用16个多态性较强、重复性好的随机引物对四川黑山羊多个种群的成年（1.5～2岁）黑山羊96只个体的血样DNA进行扩增,16个引物共扩增出170条多态的RAPD条带.对给定的标记,将“有带（1）”、“无带（0）”两类个体看作独立样本,采用SPSS软件的Compare Means中的Independent-samples T Test来比较两样本各数量性状平均值的差异.并根据两独立样本间个体表型值的分布筛选与性状真实关联的分子标记.结果表明,在黑山羊群体中共筛选到5个分子标记分别与不同性状相关,其遗传基础可能是该标记与控制性状的QTL或主基因连锁.     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒（CaPV）末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性。与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性。表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测。     

采用四引物ARMS-PCR方法检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性

试验旨在快速有效地检测泌乳奶牛的二酰甘油转酰基酶1（diacylgycerol acyltransferase 1,DGAT1）乳脂量性状的优势等位基因K232A单核苷酸多态性,确定DGAT1基因型进而确定泌乳性状,为中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择提供技术支持。选取6头泌乳初期（3头为高乳产量牛,3头为低乳产量牛）中国北方荷斯坦奶牛为研究对象,提取乳腺组织基因组DNA,分别设计1对外引物和1对内引物,建立一种四引物ARMS-PCR体系快速检测奶牛乳腺组织DGAT1基因单核苷酸多态性。结果发现,外引物扩增片段长度为512 bp,为PCR反应的阳性对照,基因型为232K扩增片段长度为369 bp,基因型为232A扩增片段长度为181 bp。PCR结果显示,6头牛的乳腺组织样本均由外部引物扩增出长度为512 bp的片段,泌乳期高乳产量奶牛和泌乳期低乳产量奶牛乳腺组织的特异性扩增片段长度均为181 bp。表明本研究选取的6头奶牛样本DGAT1基因K232A多态性均为232A型。提示该PCR鉴定方法能够快速有效地鉴定奶牛DGAT1基因型,可用于中国荷斯坦奶牛分子标记辅助选择。