核移植前激活受体卵子对牛核移植卵体外发育的影响

本研究探讨了核移植前对受体卵子进行激活、细胞融合开始时间及供体受精卵细胞周期调节对核移植卵体外发育的影响。其结果显示核移植前对受体卵子激活组的细胞融合率与对照组没有差异 ,但重组胚胎的卵裂率、8～ 16细胞期胚胎及囊胚的发育率比对照组明显提高 ;核移植前激活的受体卵子分别在卵子体外成熟开始的第30h和 4 5h与供体细胞进行细胞融合 ,结果 ,30h组的细胞融合率和卵裂率与 4 5h组没有差异 ,但发育到 8～ 16细胞期及囊胚的发育率均比 4 5h的高 ;将供体受精卵用诺考达唑 (Nocodazole)处理后 ,进行核移植的结果 ,处理组的细胞融合率、卵裂率、发育到 8～ 16细胞期和囊胚的发育率与对照组无差异     

亮甲酚蓝染色对牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究亮甲酚蓝(brilliant cresyl blue,BCB)染色选择卵母细胞对牛核移植体系的影响,本实验以未进行染色处理的牛卵丘-卵母细胞复合体(COCs)作为对照组,在成熟培养前用26μmol/L亮甲酚蓝染色90 min作为处理组,将处理组依照胞质的颜色分为蓝色组(BCB+)和无色组(BCB-),分别在成熟培养后作为受体,经胞质内注射法构建牛体细胞核移植胚胎,统计体细胞核移植的卵裂数、囊胚数和囊胚细胞数来评价其发育潜能。结果表明:BCB+组的成熟率(80.9%)与对照组(60.2%)和BCB-组(51.9%)差异显著(P<0.05);BCB+组的囊胚率(32.26%)与对照组(21.49%)和BCB-组(5.95%)差异显著(P<0.05),另外BCB+组的囊胚细胞总数(132.5)显著高于其他组(P<0.05)。结果显示,通过亮甲酚蓝染色法筛选出成熟的高质量牛卵母细胞用于体细胞核移植,可以获得更高的克隆囊胚率。     

牛胚胎的核移植

本研究是试验一种牛胚胎核移植的方法,并观察去核的胚胎移植不同龄胚胎的细胞核后的发育情况。先将原核胚胎离心处理,以显示原核,再用非穿透法取出原核,用电击法将其融合到去核的合子中。在Zimmernan细胞融合液中,以100伏电压脉冲20～40微秒,融合膜与电极平行时融合率最高(79％)。用原核胚胎观察了核移植对胚胎发育的影响。将这些胚胎的原核取出再注回,然后保存在绵羊输卵管里5天。结果,从输卵管回收到的完好的核移植胚胎中,5/29(17％)发育到桑葚期或囊胚期,而未作核移植处理的胚胎为11/30(37％)。将2个核移植胚胎移植给母牛,结果都发育成正常犊牛。而移植2-、4-或8-细胞期胚胎细胞核的去原核胚胎中,没有观察到发育现象。     

影响牛早期胚胎体外发育的因素

早期胚胎的体外培养系统比较复杂，包括培养液、温度、气相、湿度、pH值、渗透压、离子浓度、能量来源、血清成分、光、水质和培养皿等等。不同物种的早期胚胎代谢具有差异性，而培养液的组成又极为复杂，这可能是造成各种胚胎培养基差异的根本原因。因为简单培养液不能较大限度地满足胚胎发育的需求成分，所以现在一般培养胚胎都用复合培养液。     

牛胚胎早期体外发育图谱

1988年,我院卢克焕教授在爱尔兰首次报道了体外成熟卵子经体外受精后继续在体外培养成囊胚期胚胎的成就。这种胚胎移植到母牛子宫,可发育成小牛产出。现卢教授在爱尔兰Ovamass公司及英国剑桥大学ABC公司指导及从事此项工作,进行大规模商品胚胎生产,我教研室有8名同志参加,实行国内外相结合的研究。我院畜牧试验站迄今已有11头“试管牛”陆续降生。由     

不同培养体系对牛胚胎体外发育的影响

采用离子霉素和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)对牛体外成熟卵母细胞进行联合激活,激活后采用不同的培养体系进行体外培养,观察不同的培养液对牛孤雌激活胚体外发育能力的影响。3种培养体系分别为:A(0~48 h:CR1aa+3 mg/mL BSA;48 h~7 d:CR1aa+10%FBS),B(连续7 d均为SOFaa+3 mg/mL BSA),C(0~5 d:SOFaa+3 mg/mL BSA;6~7 d:SOFaa+10%FBS)。结果表明:3种培养液对卵裂率没有显著性影响,分别为87.22%,94.33%和91.30%,但囊胚发育率存在显著性差异,以A效果最好,其囊胚发育率为25.56%;C次之,囊胚发育率为11.80%;B最低,囊胚发育率为3.55%。之后选择最佳的培养液进行体外受精实验,结果表明CR1aa可用做牛胚胎体外生产的培养液。     

Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响

本研究的目的是探讨Ghrelin对水牛体外受精和孤雌激活胚胎体外发育的影响.体外成熟的水牛卵母细胞经体外受精或离子霉素孤雌激活后.分别在舍0,0.5,5,50和500 μg/L Ghrelin的培养液中进行体外培养,观察各组胚胎的卵裂率和囊胚率.结果显示,在培养液中添加不同浓度的Ghrelin对体外受精和孤雌激活胚胎的卵裂率均无显著影响(P>0.05),但添加500 μg/L的Ghrelin显著提高体外受精胚胎的囊胚发育率(33.5% vs 13.7%,P<0.05),50 μg/L或500 μg/L的Ghrelin均显著提高孤雌激活胚胎的囊胚发育率(32.4%和34.6% vs 14.5%,P<0.05).结果表明,培养液中添加Ghrelin对胚胎的早期卵裂没有影响,但可促进水牛体外受精和孤雌激活胚胎囊胚的形成.     

NGF和BDNF对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响

在NCSU-23改良培养液中分别添加不同质量浓度的脑源性神经生长因子(不rain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF),观察其对猪孤雌激活胚胎体外生长的影响。结果显示:在培养液中添加40μg/L的BDNF,可促进猪孤雌激活胚胎的囊胚形成;在猪PA胚胎培养液中添加不同质量浓度的NGF,对猪孤雌激活胚胎的在卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率影响不明显。结果表明,在NCSU-23改良培养液中添加一定质量浓度的BDNF可促进猪孤雌激活胚胎体外培养过程中囊胚的形成。     

猪核移植重组胚胎的发育能力

以ＭｃＧｒａｔｈ－Ｓｏｌｔｅｒ（１９８３）提供的去（注）核方法，将猪胚胎的单个卵裂球细胞注入去核的次级成熟卵母细胞，借助电融合的方法（ＡＣ；５Ｖ，１．５ＭＨｚ，１２－１５ｓ；ＤＣ：２ｋＶ／ｃｍ，４０μｓ。电激活／融合液：０．３ｍｏｌ／Ｌ甘露醇＋－．１ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳＯ４＋０．１ｍｍｏｌＣａｃＬ２＋７．５ｍｇ／ｍｌＣＣＢ）融入受体胞质构成重级胚，体外培养（培养液为改衣ＴＣＭ－１９９；培养条件为５％     

不同激活方法对金华猪单精注射胚胎体外发育的影响

本试验用新鲜精子和冷冻精子比较了不同激活方法对金华猪单精注射(ICSI)胚胎体外发育的影响。结果显示:不同激活处理组与对照组比较,在卵裂率上差异均不显著(P0.05),但在囊胚率上,电+化学激活组、电激活组与对照组、化学激活组比较,差异显著(P0.05)。电+化学激活组与电激活组在囊胚率上差异不显著(P0.05),对照组与化学激活组在囊胚率上差异不显著(P0.05)。新鲜精液和冷冻精液经ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上均无显著差异(P0.05)。电+化学激活和电激活都可用于金华猪ICSI体外胚胎生产的激活方法。     

牛体外成熟卵母细胞的孤雌激活及其胚胎体外培养方法的研究

本试验比较了在SOFaa培养体系下化学激活(5 μmol/L离子霉素5 min,2mmol/L 6-DMAP 4h)与电激活(1.3 kv/cm,60 μ s,1次脉冲)方法对囊胚率的影响,结果表明化学激活囊胚率显著高于电激活(12.30% vs 2.4%,p＜0.01),而二者的卵裂率(90.61%vs 94.40%)和囊胚细胞数(48.24±13.12 vs 38±3.56)均没有显著性差异(p＞0.05);同时比较了在SOFaa培养体系下第4天更换添加10% FBS的SOFaa液与在SOFaa液中连续培养7天对囊胚率的影响,结果更换添加FBS的培养液使囊胚率显著降低(3.69% vs 11.64%,p＜0.01).     

人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

为了探讨人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响,将穿刺获得的牛卵母细胞随机分为试验组和对照组,试验组以人颗粒细胞作为滋养层与牛卵母细胞在体外成熟液中共培养,对照组仅使用与试验组相同的体外成熟液培养,观察并比较两组的极体排出率、孤雌激活囊胚形成率。结果发现,试验组的极体排出率（72.35％）显著高于对照组的极体排出率（52.86％）（P＜0.01）;经过孤雌激活后,试验组的囊胚形成率为12.82％,对照组为4.76％,两组之间无显著性差异（P＞0.05）。说明人颗粒细胞可以作为牛卵母细胞体外成熟时的滋养层,两者共培养可以提高牛卵母细胞体外培养的核成熟率。     

哺乳动物胚胎体外共培养系统研究进展

该文较全面地概括了哺乳动物胚胎体外共培养系统的发展和现状 ,从共培养系统的体细胞类型以及胚胎发育的阶段等方面阐述了影响体外共培养效果的因素 ,并指出改善体外共培养条件的重要性和意义     

不同石蜡油对水牛孤雌激活胚胎体外发育的影响

水牛孤雌激活胚胎体外培养时采用石蜡油覆盖微滴培养,本文就几种不同石蜡油(协和油、Ameresco油、Sigma胚胎培养油和Sigma过滤油)对水牛孤雌激活胚胎体外发育的影响进行了研究。结果显示:在分裂率、孵化率上,不同石蜡油之间无明显差异;在7d囊胚率和总囊胚率上,分别为协和油32.1%、39.4%,Sigma胚胎培养油39.9%、42.8%,Sigma过滤油34.4%、40.2%,几组之间差异不显著;而Ameresco油7d囊胚率和总囊胚率分别为22.9%、28.8%,与Sigma胚胎培养油、Sigma过滤油之间差异显著(P<0.05)。     

培养皿种类与牛磺酸和谷酰胺对牛胚胎体外发育的影响

本研究的目的在于探讨牛磺酸（ｔａｕｒｉｎｅ）和谷酰胺（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ） 的综合效果以及对比４ 孔培养板（４ － ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ） 和培替氏培养皿（ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）对牛卵子体外受精后的分裂率、囊胚率和囊胚细胞数的影响。结果表明,牛磺酸和谷酰胺对牛受精卵体外发育的作用与胚胎的培养系统和所用培养器皿有关。利用４ 孔培养板和培替氏培养皿培养牛受精卵对牛胚胎体外发育影响的对比效果不明显。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。