野生香蕉几丁质酶基因的克隆与序列分析

以野生香蕉叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得野生香蕉几丁质酶基因全长序列,并在GenBank登录(登录号为:FJ858155)。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)全长1115bp,包含924bp的ORF、14bp的5'非编码区、177bp的3'非编码区及17bp3'poly(A)尾。该基因开放阅读框编码307个氨基酸,分子量为32424.1u,预测的理论等电点为6.28,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区。蛋白结构分析结果表明,该基因编码蛋白为跨膜蛋白,存在于胞外。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)属于酸性几丁质酶classⅠb,与大蕉几丁质酶classⅠb相似性仅为59.4%。结构分析结果表明,该基因可能具有几丁质酶/溶菌酶特点,且在过敏反应中起重要作用。     

甘蔗几丁质酶基因ScChiⅦ1的克隆与表达分析

以甘蔗(Saccharum spp.hybrid)抗黑穗病基因型崖城05-179为材料,采用同源克隆法获得了1个几丁质酶基因全长cDNA序列(GenBank登录号为KF279661),命名为ScChiⅦ1,序列长907 bp,编码299个氨基酸,属于糖苷水解酶第19家族,预测为胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚类分析显示,该基因与其他植物ClassⅦ几丁质酶基因聚为一类。基因组序列(GenBank登录号为KF279662)分析显示,该基因含有2个长度分别为615 bp和86 bp的内含子。实时荧光定量分析结果表明,甘蔗黑穗病菌胁迫下,ScChiⅦ1在抗病(崖城05-179)和感病基因型(柳城03-182)中差异表达,推测ScChiⅦ1可能参与黑穗病菌胁迫的防御反应。组织特异性表达分析结果显示,ScChiⅦ1在甘蔗叶、芽、皮、肉、根中均有表达,但在芽中表达量最高,推测与该病原从蔗芽侵入有关。研究结果为进一步研究甘蔗几丁质酶基因功能及甘蔗与黑穗病菌互作机制提供了有益的信息。     

普通小麦几丁质酶基因的克隆与表达分析

几丁质酶是植物重要的防卫因子之一,与植物抗病性密切相关。为深入了解几丁质酶基因表达及功能,先利用引物ChiF/ChiR从10份具有不同抗病性的小麦中克隆出几丁质酶基因后对其进行序列分析及原核表达分析,再利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析小麦根、茎和叶不同组织中几丁质酶基因的表达情况,并选取在小麦根、茎和叶中表达量最高的几丁质酶基因进行真菌性病害的抗性反应试验。结果表明,从10份具有不同抗病性的小麦中克隆得到5条长度约960bp的几丁质酶基因序列,其中1条序列与已公布的Chi-3基因序列(序列登录号为KJ507387)一致,其余序列命名为Cht1~Cht4(GenBank登录号为KR049247~KR049250)。序列分析表明,克隆所得序列无内含子,编码的几丁质酶属于ClassⅠb类型,也属于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。SDS-PAGE分析表明,重组质粒pE-Chi能在BL21(DE3)中表达一个33kDa左右的特异蛋白。qRT-PCR分析表明,这5种几丁质酶基因在小麦根、茎和叶中均有表达,但在不同器官中表达量差异较大,其中,叶中表达量最高,根中次之,茎中最低;同时,这5种几丁质酶基因在同一器官中表达量大小具体表现为Cht4Cht2Cht3Cht1Chi-3。选取相对表达量最高的Cht4基因验证其对真菌性病害的抗性反应,结果表明,在条锈菌胁迫下,Cht4基因在抗病材料92R137中的表达量显著高于感病材料铭贤169,并且均高于同等条件下接ddH2O的表达量。本研究扩增到的几丁质酶基因在小麦中组成型表达,说明其参与了小麦的正常生长发育过程;Cht4基因的表达受条锈菌诱导,推测其可能参与了小麦叶部抗条锈菌的防御反应。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶基因(chiD)的克隆与原核表达

以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。     

玫烟色棒束孢几丁质酶基因上游调控序列克隆与结构预测分析

为探明玫烟色棒束孢几丁质酶基因Ifuchi1的表达调控机理,根据Ifuchi1基因组全长核苷酸序列,采用基因组步移方法,获得Ifuchi1的5′-上游区序列(总长为2 402 bp)。与cDNA 序列进行比对,其中含有2个内含子。TFSEARCH 1.3 软件分析转录因子结合位点的结果显示,该序列中没有明显的TATA和CAAT框,含有4个可能的碳调控因子的结合位点5＇>(g/c)YggRg<3＇和3个氮调控因子的结合位点-相隔很近的GATA。其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。本研究结果为深入研究玫烟色棒束孢几丁质酶基因的表达调控机制及其分子机理奠定了一定基础。     

稻瘟病菌一个假想几丁质酶的表达分析

为研究稻瘟病菌几丁质酶在稻瘟病菌形态建成和致病过程中的作用,对稻瘟病菌MGG_08054.6编码的一个假想几丁质酶进行生物信息学分析、基因表达及其融合蛋白分泌特性研究.结果显示:稻瘟病菌基因MGG_08054.6编码的蛋白MoChil与里氏木霉、桔绿木霉、烟曲霉、禾布氏白粉菌已知的18家族几丁质酶(EC 3.2.1.14)蛋白序列同源性大于40%,并具有几丁质酶催化区域的两个保守基序GGW和DG-D-DWE及部分几丁质结合区的活性位点,该蛋白序列经程序SignalP 3.0分析含有信号肽,在16T-17S和26Q-27S处有两个可能的剪切位点;将MGG 08054.6基因在稻瘟病菌Guy11进行过量表达,获得分泌蛋白,证明了该蛋白的分泌特性.半定量RT-PCR分析表明,该基因在不同生长发育阶段及侵染水稻阶段均有表达,其中菌丝阶段表达量最高.     

核酸酶BN基因的克隆及序列分析

从解淀粉芽孢杆菌中提取染色体ＤＮＡ，经过ＰＣＲ扩增得到Ｂａｍａｓｅ（核酸酶ＢＮ）基因，然后克隆到质粒Ｐ＾ＧＥＭ－７２ｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点上并进行序列分析。结果表明，核酸酶ＢＮ基因的核苷酸序列与已报道的序列相比具有９９．７％的同源性，长度为３３６ｂｐ，根据核苷酸序列推断的氨基酸序列则完全一致。该工作为以后利用核酸酶的特异表达来获得雄性不育植物打下了基础。     

通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶基因导入马铃薯

选用两个生产上主栽马铃薯品种“鲁引 1号”和“鲁引 4号”的试管微型薯为材料 ,通过农杆菌介导成功地将菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯中。试管微型薯薯片与农杆菌共培养 3d后 ,转到含卡那霉素 10 0mg/L的分化培养基上诱导不定芽分化。待抗性芽长到 1 0～ 1 5cm高时 ,转入含卡那霉素 10 0mg/L的液体培养基中进行生根筛选。经过分化和生根两轮筛选的转化植株的PCR检测结果均为阳性 ,而未经转化的对照植株为阴性 ,证明该筛选系统是可靠的。早熟品种鲁引 1号的转化频率明显高于晚熟品种克新 4号 ,其最高转化频率为 4 1 0 % ,平均每个外植体可得到 3 85株转化苗。转化植株的抗病性鉴定正在进行中     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

将来源于国际马铃薯中心 (InternationalPotatoCenter ,ClP)PVX病毒毒源接种至烟草上 ,对表现明显症状的烟草叶片提取马铃薯病毒X (PVX)总RNA ,人工合成引物P1、P2 ,通过RT PCR扩增合成PVX cp的cDNA ,井将其克隆到pGEM T载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定 ,结果表明 :该基因由 714个核苷酸组成 ,编码 2 38个氨基酸 ,与文献 (分别来源于亚洲、非洲和欧洲 )报道的 4个 pVX cp基因相比同源性为 81%～ 95 % ,其编码的氨基酸同源性均在 90 %以上。说明PVX cp具有较高的保守性。用内切酶将PVX cp基因自克隆载体 pGEM切下 ,定向插入到表达质粒 pBV2 2 0的启动子Pr、Pl的下游 ,构建了该基因的原核表达载体pBV pvx ,为进行该基因的原核表达和抗血清的制备奠定了基础。     

巴西橡胶HMG—CoA还原酶基因cDNA的扩增与克隆

从橡胶树高产无性系(热研7—33—97)的新鲜胶乳制备总RNA,采用磁吸附法从总RNA纯化mRNA,加反转录酶得到cDNA,以cDNA为模板,设计并人工合成一对特异引物,采用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增到一段约1.0kb的DNA片段,用1％低融点琼脂糖电泳回收目的DNA片段,然后将目的DNA克隆到pGEM—5Zf(-)质粒载体上。     

向大豆导入几丁质酶基因的初步研究

以根癌农杆菌的Ｔｉ质粒为介导,将抗真菌病的几丁质酶基因,导入默经江省栽培大豆一东农３７号,吉林２８号等１４个品种。从子叶节和下胚轴诱导出丛生芽,并再生植株,经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测,经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测的１１３株大豆幼苗中,有７株呈阳性反应,证明几丁质酶基因已导入并整合到大豆的基因组中。     

南农87C-38大豆优质11S球蛋白Gy7基因克隆及序列分析

大豆种子不仅富含蛋白质,而且赖氨酸含量较高,利用大豆高赖氨酸基因能够弥补谷类作物种子赖氨酸含量的不足.运用现代分子生物学技术,从高蛋白大豆南农87C-38中克隆11S球蛋白Gy7全基因及cDNA序列.经生物公司测序后,利用vector NTI软件将所克隆的Gy7全基因及cDNA序列与Genbank(AF319776和AF319777)报道的序列进行比对分析,同源性分别为99%和99.6%.序列比对结果显示,Gy7基因cDNA与Genbank报道的序列之间所有的核苷酸差异都位于第3外显子.由此推测,第1、第2和第4外显子编码的氨基酸对于G7多肽形成特定高级结构可能具有非常重要的作用,它们在进化过程中受到的选择压力可能比第3外显子更强.根据遗传密码表推测,克隆的Gy7与Genbank报道的cDNA序列所编码的多肽,两者存在2个氨基酸组成的差异.大豆球蛋白Gy7优质基因的获得为今后利用转基因技术改良水稻、小麦等谷类作物的营养品质奠定了基础.     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料,利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段,将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序,结果证明,此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBIFe,并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

大豆花叶病毒5个分离物的鉴定及外壳蛋白序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其外壳蛋白(CP)基因片段并进行测序,结果表明:5个分离物CP基因全长均为795个核苷酸,编码产生265个氨基酸.同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为91.1%～97.1%,由此推导的氨基酸序列同源性为98.1%～99.2%.结合5个分离物在8个大豆品种上的致病性反应得出,5个分离物在8个鉴别寄主上的致病性反应和序列差异的比较表明,分离物在8个鉴别寄主上致病性反应相差越大,其CP基因氨基酸序列差异就越大,由此证实SMV的CP基因与致病性反应之间有一定的联系.     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的克隆及全序列测定

自田间采集的马铃薯病叶中提取马铃薯Y病毒 (PVY)总RNA ,人工合成引物P1、P2 ,通过RT PCR扩增合成PVY cp的cDNA ,并将其克隆到 pGEM TEasy载体上。经限制酶谱分析后进行全序列测定 ,结果表明 :该基因由 80 1个核苷酸组成 ,编码 2 67个氨基酸 ,与文献报道的 3个PVY cp基因相比同源性均在 90 %以上 ,且其编码的氨基酸同源性均在 94 4 %以上。说明PVY cp基因具有较高的保守性     

大豆抗病相关基因SR1正反义植物表达载体的构建及遗传转化研究

实验构建了CaMV35S启动子控制下的大豆抗病相关基因SR1的正反义植物双元表达载体pBISR1( )和pBISR1(-).通过根癌农杆菌叶盘转化法,将正义和反义SR1基因导入烟草Ha-vana 425,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株.经PCR和PCR-Southern印迹分析,证明抗性植株中整和了SR1基因,RT-PCR分析进一步表明正义和反义基因皆能转录为完整的mRNA,经疫霉根腐接种及抗病性鉴定表明,转反义基因株系和未转基因株系均轻微感病,而转正义基因株系始终没有出现感病症状.