家蚕翅原基的一些发育规律研究

为进一步解明家蚕的生长发育机制 ,调查了家蚕 5龄幼虫及蛹期翅原基的大小和形态变化 :翅原基在 5龄前期生长缓慢 ,变态前生长最快 ,2～ 3d及 8～ 11d为形态变化最大的两个时期 ;蛹期翅芽基本不变 ,3d始见初生鳞毛 ,5d时已经呈浓密的毛状 ,8d时翅面鳞毛发育成柳叶状 ,之后逐渐出现分叉 ,9d花纹清晰可见 ,化蛾后翅面鳞片呈现棕榈叶状。进行翅原基摘除和异位移植发现 :4个翅原基全部摘除后家蚕仍能正常生长并发育成蛹和具有交配及产卵能力的蛾 ,表明家蚕血球和造血器官有很强的再生能力 ,家蚕血球细胞的生成可能具有更复杂的机制 ,由此证明了家蚕翅原基异位移植的可行性。     

重离子射线对家蚕幼虫造血功能的影响

用碳离子和氦离子射线照射家蚕 5龄蜕皮后 72h(5 3d)幼虫造血器官 ,体内和体外同时调查了造血器官形态结构和造血功能的变化。离子射线照射后家蚕造血器官很快开始解离 ,解离速度随照射剂量的增加而加快。体外 2 5℃悬滴培养 ,离子射线照射后的造血器官先失去血球分泌功能 ,然后造血器官萎缩解离 ,其变化速度也随射线剂量增大而加快。家蚕翅原基比造血器官对重离子射线的抵抗力强 ,用翅原基的存活状态可以检验离子射线对造血器官的损害程度。     

家蚕血球的生成机理

家蚕具有开放式的循环系统,各个器官直接沉浸在血液中.幼虫的背中线上有1条背血管,习惯上称之为心脏,背血管通过伸缩运动来提供动力以维持血液循环.家蚕的血液中则存在着很多细胞,即血球细胞.血球细胞在家蚕的代谢、变态以及免疫等方面承担着重要角色,与其生长发育及生理变化有着密切的联系.而血球细胞又是由造血器官产生并释放到血液中的,血液中的血球还可以通过有丝分裂进行增殖.造血器官紧密附着在翅原基的内侧,解剖时很难明确地将两者分开,因此习惯上被统称为翅原基-造血器官复合体,共有4个.本文就家蚕幼虫血球的生成机理作一综述.     

家蚕翅原基发育关联基因BmHMGS的鉴定与表达特征分析

家蚕幼虫的翅原基最终发育为成虫的翅,翅原基发育与家蚕的变态发育紧密关联。为了研究激素作用下家蚕翅原基发育的分子调控机制,以经过蜕皮激素20E体外诱导培养和未经诱导培养的家蚕5龄幼虫翅原基为材料分别提取总蛋白质,利用Shotgun质谱分析在20E诱导组的翅原基中获得132种差异蛋白,在未经20E诱导组的翅原基中获得76种差异蛋白。进一步通过生物信息学技术及GO分类法在20E诱导组的翅原基的差异蛋白中,筛选到1个具有生物调节作用的酶类蛋白基因Bm HMGS作为翅原基发育相关的候选基因,设计引物并以上蔟1 d的蚕体翅原基总RNA反转录得到的c DNA为模板,克隆了该基因。通过qRT-PCR检测到Bm HMGS基因在幼虫5龄1 d、上蔟3 d、蛹期1 d蚕体内的表达量较高,其中在上蔟3 d的表达量达到峰值。构建重组载体进行Bm HMGS的原核表达并制备抗体后,采用Western blot技术在5龄1~7 d和上蔟1~3 d的蚕体翅原基、脂肪体中及上蔟1~3 d的生殖腺中都可以检测到Bm HMGS的表达,并且在翅原基中的表达没有发育时期特异性。研究结果表明,从20E诱导组的家蚕翅原基中鉴定的Bm HMGS与翅原基发育相关,其表达在5龄至上蔟阶段没有时期和组织的特异性,推测Bm HMGS是一个具有多种生物学功能的基因。     

环境激素壬基酚对体外培养家蚕造血器官的影响

目的:为探讨环境激素对鳞翅目昆虫组织的影响及其利用途径,研究了壬基酚(NP)对家蚕造血器官和翅原基的影响。方法: TC-100培养基中添加对壬基酚(NP),悬滴培养方法体外培养家蚕5～3d幼虫造血器官和翅原基。结果:0．016mmol/L的NP,造血器官和翅原基的发育变慢,造血器官分泌血球数量减少、分泌时间延迟;NP达0．032mmol/L,培养144h内部分组织发黑死亡、无血球分泌;0．128mmol/L的NP,96h后大部分组织萎缩死亡,培养144h无血球分泌。结论:家蚕幼虫造血器官接触NP后,首先影响血球分泌功能,进一步导致造血器官萎缩死亡,对翅原基的不良影响也导致器官萎缩死亡。NP对造血器官和翅原基的影响都有明显的浓度效应。     

家蚕翅原基发育的研究进展

家蚕翅原基在幼虫期生长缓慢,从五龄开始至蛹期,翅原基的形态发生了巨大的变化。造成这些变化的原因是蜕皮激素和保幼激素的作用导致了一系列翅原基发育相关基因的转录、表达水平的改变。翅原基易于摘取,体外培养的技术方法也已经很成熟,这对于研究翅原基的发育是很好的条件,基于翅原基是个很好的研究材料,很多学者为揭示翅原基的发育过程做了大量的实验研究。     

家蚕变态期脂肪体形态结构特征

通过对家蚕变态期脂肪体解剖和石蜡组织切片观察发现：脂肪体从5龄未到蛹后期由柔软片状组织变成絮状组织,分布在整个体腔;从预蛹期开始,家蚕脂肪体经HE（Hematoxylin—Eosin）染色,内外层脂肪体着色存在明显差异,内层脂肪体颜色较深,且细胞较小,揭示了两类脂肪体细胞结构的存在着差异;脂肪体所含空泡随着变态发育进程逐渐增多,并内层脂肪体空泡比外层多;脂肪体的消溶从5龄开始,蛹2天达到高峰,并逐渐退化成离散溶解状;但在整个变态期间,存在部分细胞核染色清晰的脂肪体细胞。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

家蚕胸足的发育变化

家蚕幼虫附肢的再生能力在一定程度上反映了家蚕对损伤、病变的愈伤和修复能力,在理论和实践上都有重要意义。研究取材于5龄期不同时间段的家蚕胸足,通过切片技术观察不同发育阶段胸足细胞的发育变化。结论:在5龄第7天,明显可见两个胸足细胞,随着蜕皮的逐步进行,各组织器官发生溶离。到5龄第8天化蛹前,胸足细胞形态上渐渐变小,萎缩。蛹期在封闭条件下进行第二次变态发育。羽化前,胸足细胞分化加快,重新形成成虫的胸足。     

家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析

多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。     

植源蜕皮激素对无脑蓖麻蚕蛹血淋巴蛋白质组分的影响

<正> 蓖麻蚕在蛹期里,幼虫组织器官分解,成虫器官芽发育,尤其是翅芽的发育和雌性卵巢的发育。而蛹期的血淋巴则是成虫器官芽发育的环境条件,为成虫器官芽的发育提供物质基础和运送激素等活性物质。因此,蛹期的血淋巴中物质成分的变化,特别是血淋巴蛋白质组成种类的变化,是昆虫生理学工作者关注的问题之一。已有人利用聚丙烯酰胺电泳,研究过家蚕和蓖麻蚕五龄幼虫血淋巴蛋白质种类,但尚未见蓖麻蚕蛹期血淋巴蛋白质分析的报道。     

家蚕中肠上皮细胞增殖和分化的初步研究

通过分析家蚕自幼虫期到蛹期发育过程中肠上皮细胞的增殖与分化情况,鉴定家蚕中肠干细胞的潜在定位。采用苏木精和伊红(Hematoxylin and Eosin,H&E)染色与4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色追踪变态和发育时期家蚕中肠的形态结构及细胞组成变化,结果显示,幼虫经历蜕皮及变态时,中肠形态结构以及中肠上皮细胞组成均发生明显变化:在幼虫每个龄期的盛食期肠壁较薄,眠前期(蜕皮前)明显变厚,至眠期其厚度达到峰值;中肠上皮层存在柱状细胞(CC)、杯状细胞(GC)和再生细胞(RC)3种细胞,3种类型细胞随龄期逐渐增多,其中各龄期柱状细胞持续增多,至眠期达到峰值,靠近基底膜的小细胞在眠前期增多。利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BrdU)和磷酸化组蛋白(Phospho-histone H3,PHH3)免疫荧光染色检测到中肠上皮细胞,尤其是中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞在幼虫各龄眠前期的增殖率最高。同时通过BrdU滞留标记实验在中肠上皮层靠近基底膜处发现了BrdU滞留阳性信号。研究结果发现家蚕幼虫蜕皮时中肠上皮层靠近基底膜处的小细胞发生快速增殖,推测这些小细胞中存在着潜在的家蚕中肠干细胞。     

柞蚕蛹期血淋巴蛋白质的等电聚焦分析

<正> 昆虫血淋巴是细胞外体液,浸润着虫体内所有组织和细胞。全变态昆虫的蛹期是重要的变态期,在此期间,进行着幼虫组织的分解和成虫组织形成。血淋巴中蛋白质种类的变化情况,是昆虫生理学者关注的问题之一。柞蚕是典型全变态昆虫,柞蚕蛹期里翅芽发育,与此同时,在雄蛹中睾丸进一步发育成熟,而在雌蛹中卵巢开始发育,直至完全成热。因此,有必要分析柞蚕蛹期血淋巴蛋白质种类及其消长变化特点,为逐步深入阐明蛹期成虫器官芽生长发育过程中,利用血淋巴中的蛋白质致使血淋巴蛋白质种类出现有关变化,提供分析资料。 关于昆虫血淋巴蛋白质的分析工作,过     

家蚕无翅突变种(fl)受脱皮激素诱导的基因的表达模式

家蚕无翅突变种(fligellos fl)的蛹和成虫缺少4个翅芽。fl突变型的幼虫似乎在四龄期以后翅芽的分化就停止了。以前的研究者认为fl突变种的翅芽是在变态期间丢失了对蜕皮激素的响应。为了证明这种假说,我们在含有和不含有20—羟蜕皮酮的条件下分别培养来自野生型(WT)     

家蚕Prosβ1基因在蛾翅及早期发育中的作用

家蚕是鳞翅目的代表物种,研究其翅发育相关基因有助于理解影响昆虫翅发育的内在因素,为鳞翅目害虫的遗传防治提供理论基础和靶标。家蚕的蛋白酶体β亚基1(Bombyx mori proteasome subunitβtype-1,BmProsβ1)是家蚕蛋白酶体核心颗粒的组件之一,负责水解折叠错误或细胞不需要的蛋白质,在细胞发育和器官形成过程中发挥重要作用。利用RNAi干扰技术,在家蚕体腔翅原基附近注射体外合成的针对BmProsβ1基因的小RNA,qRT-PCR检测试验组翅原基中BmProsβ1的表达水平得到有效抑制;对干扰后翅表型的统计结果显示,试验组中小翅个体的比率占52.38%,而对照组中未出现小翅个体。表明在BmProsβ1表达受到抑制的情况下,会严重影响家蚕翅的发育。进一步利用CRISPR/Cas9技术对BmProsβ1进行基因敲除实验,结果显示注射sgRNA与Cas9 mRNA的蚕卵孵化率极低并在幼虫期死亡,而对照组孵化率达到37.92%。这表明BmProsβ1基因在家蚕的早期发育过程中也起到重要作用,其功能缺失会导致家蚕胚胎和幼蚕致死。     

抑制类胰岛素肽BBX-B8基因的表达对家蚕抗逆性的影响

家蚕类胰岛素肽(bombyxin)具有调节糖代谢、促进翅芽和造血器官细胞增殖、调控前胸腺分泌活性等功能。为探讨家蚕类胰岛素肽其它的生理功能,将Bombyxin B家族的BBX-B8基因克隆进pGEM-T载体,通过体外转录合成BBX-B8 dsRNA,研究RNAi介导的BBX-B8基因沉默对蚕体耐高温、低温和饥饿的能力及部分保护酶活性的影响。Western blotting检测显示,给家蚕5龄2d幼虫注射1μg/μLBBX-B8 dsRNA(10μL/头)3d后,脑组织中BBX-B8的表达水平下降30.80%。给家蚕5龄3d幼虫注射1μg/μLBBX-B8 dsRNA(10μL/头)2d后,血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)分别提高17.81%、41.86%,而过氧化氢酶(CAT)活性与对照无显著差异。给家蚕5龄3d幼虫注射BBX-B8 dsRNA 2d后进行高温(40℃,3h)和低温(4℃,3h)冲击,化蛹率比对照提高12.76个百分点;注射BBX-B8 dsRNA后禁食处理,在饥饿状态下的化蛹率比对照低9.29个百分点。研究结果提示:在家蚕5龄幼虫期抑制BBX的表达,可刺激血液中SOD活性上升,增强蚕体抗氧化能力,从而产生一系列生理应激反应,导致其对高温和低温的应激能力提高;家蚕的代谢活动加剧,能量消耗增加,耐饥饿能力下降。     

家蚕含RRM保守结构域蛋白基因(Bmrrm)的克隆及序列分析与表达研究

RRM(RNA recognition motif)是RNA结合蛋白中广泛存在的一种保守结构域。从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条含有RRM保守结构域的cDNA,命名为Bmrrm(GenBank登录号:DQ534196)。Bmrrm基因全长1086 bp,开放阅读框大小为894 bp,编码297个氨基酸残基,蛋白理论分子质量33.2 kD,等电点9.69,预测的三级结构由2个α螺旋和4个β折叠组成。将该基因的PCR扩增产物于原核表达载体pET-28a(+)中表达后经SDS-PAGE检测,在36 kD处的特异性蛋白条带与预期值相符,重组蛋白以可溶的形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1∶6400。采用荧光定量PCR方法对家蚕卵、5龄幼虫、蛹、蛾4个发育时期以及5龄幼虫各组织中Bmrrm的mRNA转录水平进行检测比较,发现在蛹期和5龄幼虫生殖腺、表皮中的转录水平较高。采用免疫印迹方法在家蚕的卵期、5龄幼虫、蛹期,以及5龄幼虫的生殖腺、表皮、脂肪体中检测到BmRRM蛋白有明显表达,但在蛾期及5龄幼虫的其他组织中未检测到该蛋白。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,BmRRM蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞核,仅少量分布于细胞质。初步推测BmRRM蛋白参与蚕体内RNA前体的剪接、细胞定位及维持稳定等转录后调控过程。     

追寄蝇寄生对家蚕龄期经过的影响及其机制

家蚕追寄蝇（Exorista sorbillans Wiedemann）是危害蚕业生产的重要害虫。为深入了解家蚕追寄蝇对家蚕龄期经过的影响及其机制,本研究将5龄第1 d的家蚕用于追寄蝇寄生,记录家蚕从5龄起蚕至预蛹期第1 d的时间,并解剖和收集寄生后1 d、3 d和5 d的家蚕血清、前胸腺和脂肪体,分别检测20E(20-hydroxyecdysone)滴度、20E合成酶基因转录水平和20E下游基因转录水平。结果表明：追寄蝇寄生的家蚕从5龄起蚕至预蛹期历经10.1 d,发育时间比对照组缩短了0.7 d。同时,在追寄蝇寄生3 d和5 d后,家蚕的20E滴度与对照组相比均显著上升,且20E合成酶基因和下游响应基因的转录水平均发生改变。20E滴度的上升和下游响应基因转录水平的改变可能是引起家蚕龄期经过缩短的重要原因。     

家蚕预蛹粉对糖尿病模型小鼠的降血糖效果试验

利用变态发育至预蛹期的家蚕制备预蛹粉及脱脂预蛹粉,并添加至饲料中饲喂四氧嘧啶诱导糖尿病模型小鼠,观测小鼠血糖值及基本生理状况和主要脏器指数的改变。试验组糖尿病模型小鼠饲喂添加5%家蚕预蛹粉的饲料后,其"三多一少"症状有显著改善,肝脏指数、肾脏指数和血糖浓度均极显著降低,脾脏指数极显著提高,其中空腹血糖(FBG)比对照模型组小鼠下降20.38%,餐后血糖(PBG)下降39.07%;饲喂添加5%脱脂预蛹粉饲料的糖尿病模型小鼠,其控制血糖效果明显低于预蛹粉添加组。试验组糖尿病模型小鼠饲喂添加1%、5%和10%预蛹粉的饲料后的糖化血红蛋白(HbA1 c)均极显著低于对照模型组小鼠,分别降低了31.39%、45.89%和54.42%;5%和10%预蛹粉添加组模型小鼠的血清C肽极显著高于对照模型组小鼠,分别增加了18.97%和29.31%。试验结果显示,家蚕预蛹粉能有效控制糖尿病模型小鼠的血糖水平,并改善小鼠的基本生理状况和脏器指数,但总体效果略低于拜糖平添加组;脱脂后的家蚕预蛹粉的降血糖效果显著降低,提示其降血糖活性分子可能存在于脂溶性物质中。     

家蚕翅原基表皮蛋白基因BmWCPs的生物信息学分析与激素诱导表达特征

翅原基表皮蛋白(WCPs)在昆虫翅的发育中起着非常重要的作用。为了研究家蚕翅原基表皮蛋白基因BmW CPs的表达是否与蜕皮激素(20E)的调节有关,用生物信息学方法分析BmW CPs基因的序列结构与系统进化特点,并通过半定量RT-PCR检测蜕皮激素对部分BmW CPs基因表达的诱导作用。11个BmW CPs基因成簇分布在家蚕基因组中,除BmW CP6和BmW CP10分别分布在第7号、第21号染色体外,其余的BmW CPs均分布在第22号染色体上;11个BmW CPs的核苷酸序列长度为588~2 670 bp,编码115~312个氨基酸,蛋白质分子质量12~35 kD,等电点4.30~7.45;11个BmW CPs基因的ORF内均有内含子插入,81.82%的基因含有2~3个内含子,内含子长度50~5 958 bp,在50~300 bp之间分布频率最高,占46%。将解剖获取的上蔟1 d蚕体的翅原基进行体外培养,并用浓度为2μmol/L的20E直接处理12 h后再常规培养18 h,提取翅原基总RNA并反转录合成cD NA,经半定量RT-PCR检测样品中BmW CPs的表达水平显著上调。依据上述研究结果初步认为,用蜕皮激素直接处理12 h后再常规培养18 h的脉冲作用,可诱导基因组中成簇分布的BmW CPs在翅原基组织中大量表达,以利于家蚕完成翅原基的变态发育。