豆科模式植物——蒺藜苜蓿

由于蒺藜苜蓿具有高的遗传转化效率、生长期短、染色体组为2×8、基因组小、自花授粉、固氮等特点,使它成为豆科生物学和基因组学研究的模式植物。本研究描述了蒺藜苜蓿的形态特征,介绍了苜蓿属植物的系统关系及蒺藜苜蓿的分类学地位,概述了蒺藜苜蓿遗传图谱构建和基因组学研究的进展。     

蒺藜苜蓿耐酸铝性状的全基因组关联分析

铝毒害是酸性土壤耕种的主要限制因素,每年造成大量作物减产。蒺藜苜蓿是紫花苜蓿的一年生近缘种,广泛分布于世界各地,是紫花苜蓿遗传改良的重要基因资源。本研究利用蒺藜苜蓿群体的耐酸铝性状差异,进行全基因组关联分析,筛选蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的遗传位点,共得到58个与蒺藜苜蓿耐酸铝性状相关的SNP标记。对其周围基因进行功能注释分析,发现这些SNP位点主要参与苜蓿的细胞壁、脂质代谢、环境胁迫响应过程、氧化还原反应过程以及小分子转运等过程。最后,通过基因组选择方法将发掘SNP标记应用到蒺藜苜蓿耐酸铝性状的预测,预测准确性达到0.80,这说明本研究发掘的SNP标记可以用于蒺藜苜蓿及其近缘物种紫花苜蓿耐酸铝性状的遗传改良。     

蒺藜苜蓿遗传转化体系研究进展

豆科植物作为重要的农作物和牧草资源, 是人类和动物的重要蛋白质来源。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是豆科模式植物, 其遗传转化体系的建立和完善对促进豆科植物基因工程研究和功能基因组学研究均具有重要意义。本文结合国内外蒺藜苜蓿基因工程研究动态, 从转化方法、外植体类型、菌株型、载体和培养基使用等方面对R108、Jemalong 2HA、Jemalong J5、Jemalong A17和Jemalong M9-10a这5种生态型蒺藜苜蓿转基因研究进展进行了系统综述, 并对当前存在的问题及今后的研究趋势进行了讨论, 以期为豆科植物遗传转化体系进一步完善提供参考。     

蒺藜苜蓿CB L基因家族全基因组鉴定及表达分析

采用生物信息学方法在蒺藜苜蓿全基因组中共筛选得到16条CBL同源序列,基因家族成员在基因组中不均匀分布.蒺藜苜蓿CBL基因均包含内含子和外显子,外显子介于7～10个之间;编码蛋白序列介于202～308个氨基酸之间,含有变异程度不同的3～4个EF-hand结构域;家族成员中共鉴定到5个保守模体,且在N端大多含1～3个豆蔻...     

蒺藜苜蓿、天蓝苜蓿、金花菜基因组SNP穿梭标记开发

蒺藜苜蓿是继拟南芥和水稻之后又一个进行全基因组测序的植物,利用蒺藜苜蓿的基因组序列,开发出可以在其他豆科植物上应用的分子标记,即穿梭标记,已成为缺乏基因组信息或基因组复杂的豆科植物基因组学及分子遗传学研究的有效手段。天蓝苜蓿和金花菜是我国最重要的两种一年生苜蓿,由于缺乏有效的分子标记,这两种苜蓿在基因组水平上的研究很少。SLAF-seq是近年来开发出的一种简化基因组测序技术,具有高通量、准确性、成本低、周期短的优点,已在众多物种的全基因组SNP标记开发上得到应用。本研究通过SLAF-seq技术对12份蒺藜苜蓿、天蓝苜蓿和金花菜材料进行简化基因组测序,共得到28.04×10⁶个读长的测序数据,276432个高质量的SLAF标签,其中58748个SLAF标签为多态性标签,平均测序深度为17.44。在58748个多态性SLAF标签中,共检测出次要基因型频率(MAF)大于0.05的SNP标记189133个。本研究开发出的SNP标记可用于一年生苜蓿的遗传多样性、遗传图谱构建和重要农艺性状的QTL定位等的研究,其种间穿梭的特性可为苜蓿属种间基因组排列顺序、系统进化关系、比较图谱构建等方面的研究提供帮助。     

蒺藜苜蓿MtNSN1的克隆与功能分析

核干因子(NS)是一类广泛存在于动物细胞核中的GTP结合蛋白,主要参与胚的形成和细胞增殖,对维持细胞周期具有重要作用。本研究旨在初探蒺藜苜蓿MtNSN1的表达模式及其对生长发育的调控功能。克隆获得蒺藜苜蓿MtNSN1基因cDNA全长2193bp,其中开放阅读框为1800bp,编码599个氨基酸,蛋白分子量133.7kDa。进化树分析显示MtNSN1与大豆NSN1的氨基酸同源性为66.67%。组织器官表达分析表明,MtNSN1在蒺藜苜蓿花中表达量最高,根次之,叶中表达量最低。RNA原位杂交的结果显示该基因主要在蒺藜苜蓿生长发育活跃的茎尖分生组织及其周围的幼嫩叶中表达。MtNSN1转化野生型拟南芥得到超表达植株,通过统计分析表明超表达植株的主根长度和叶片数量都明显优于野生型。在超表达植株中5个细胞周期标记基因的表达水平均比野生型拟南芥显著上调;利用DNA化学诱变剂博来霉素对植株进行处理,发现超表达植株的根系受抑制程度小于野生型。以上结果表明,MtNSN1与蒺藜苜蓿茎尖分生组织的维持及地上、地下器官的发育有关,同时异源表达MtNSN1在转录水平上影响拟南芥细胞周期的表达。     

蒺藜苜蓿叶绿体密码子偏好性分析

本文对蒺藜苜蓿叶绿体基因组全序列密码子进行分析,筛选出50条CDS(coding DNA sequence)利用CodonW软件进行分析其密码子使用模式。结果显示,蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子第3位碱基GC含量为26.9%,即第3位密码子富含A和U,ENC值在37.11~51.91之间密码子偏好性较弱。相对同义密码子使用度分析显示RSCU值大于1的密码子有23个,其中以A和U为结尾20个。中性绘图分析显示GC₁₂与GC₃的相关系数为0.341,相关性不显著,回归系数为0.4843;单基因ENC比值多分布在-0.05~0.05,即大部分基因ENC值离ENC期望值较近;对应性分析,第一轴显示了12.50%的差异为主要影响因素,第一轴与ENC和GC₃的相关系数分别为0.091和-0.092,均相关不显著。综合这几项分析发现蒺藜苜蓿叶绿体基因组密码子偏好性主要受到突变的影响,但是并不是唯一的影响因素,其他因素对密码子偏好性也可能有一定的影响。最终通过高表达优越密码子方法确定得出UUA、UUG、CCU等23个密码子为最优密码子,为之后对外源基因进行改造,提高其在叶绿体中的表达效率奠定了基础。     

蒺藜苜蓿LEA基因家族全基因组分析

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一类在种子胚胎发育后期特异表达并受发育阶段及脱水信号调节的脱水保护蛋白,在响应植物干旱、低温、高盐等逆境胁迫中具有重要功能。本研究利用生物信息学手段,在全基因组水平对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)LEA基因家族进行分析,并对其进化、基因结构、进化压力、染色体定位及基因表达模式进行了系统分析。本研究共筛选出23个蒺藜苜蓿LEA家族基因,可分为8个亚家族。基因定位结果表明,23个蒺藜苜蓿LEA基因分布于除6号染色体外的其他7条染色体上,但分布不均匀;家族成员外显子数目都不超过两个,结构简单。不同组织表达谱分析结果显示,LEA家族基因具有不同的组织表达模式,并受干旱逆境胁迫调控。本研究结果可为蒺藜苜蓿LEA基因家族的功能分析奠定基础。     

蒺藜苜蓿子叶节高频再生系统的建立

通过直接的芽器官发生途径,建立了蒺藜苜蓿Medicago truncatula子叶节外植体的高频植株再生体系.选用在高达5 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)的种子萌发培养基上生长3 d的蒺藜苜蓿幼苗,制备获得由1片子叶和半个胚轴组成的子叶节外植体.以SH培养基为基本培养基,对不同浓度α-萘乙酸(NAA)和6-BA组合诱导不定芽形成条件进行优化的结果表明,不定芽诱导培养基中仅用浓度为4 mg/L 6-BA的平均不定芽数达到3.56,显著优于与其它生长调节物质组合的处理.     

蒺藜苜蓿种子休眠机制及其破除方法研究

以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)种子为试验材料,通过测定种子生活力、发芽率、吸水率及粗提物的生物活性;并用不同浓度的赤霉素(GA₃)浸种后4℃低温层积或同浓度硝普钠(SNP)浸种,揭示蒺藜苜蓿种子休眠原因及破除方法.结果表明:蒺藜苜蓿种子具有生活力;30 d内裸粒种子发芽率为100%;破皮种子的吸水率显著高于完整种子;随着蒺藜苜蓿各部分粗提物浓度的升高,白三叶(Trifolium repens)草种子萌发和幼苗生长显著降低;0.1~0.7 mmo·L^-1的GA₃浸种后低温层积或同浓度SNP浸种均可以显著提高种子的发芽率,其中以0.1 mmol·L^-1 GA₃浸种后低温层积或同浓度的SNP处理效果最好.表明蒺藜苜蓿种子的休眠属于综合性休眠,可用GA₃浸种后低温层积或SNP浸种来解除其休眠.     

截形苜蓿蛋白质组学研究进展

蛋白质组学研究是功能基因组研究的重要手段.简述了蛋白质组学研究的概念和主要技术,详述了蛋白质组学在截形苜蓿组织或细胞器蛋白质组成、生长发育、响应生物和非生物胁迫等方面应用研究成果,分析了存在的问题与发展前景.     

蒺藜苜蓿种子产量相关性状的遗传分析

通过对蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)种子产量相关性状的田间调查,解析影响蒺藜苜蓿种子产量的主要构成因素。结果表明:搜集的38份蒺藜苜蓿种质资源在种子产量方面存在显著差异(P<0.05),选系J1.12单株平均种子产量明显高于其他材料;不同种质在分枝数、伸展长度、小花数、结荚数和百荚重等构成因素上存在显著差异(P<0.05);对蒺藜苜蓿种质种子产量与其构成因素间的相关性进行分析发现,伸展长度与种子产量相关性最大,相关系数为0.719,每荚种子数与种子产量相关性最小。通过系统聚类,参试蒺藜苜蓿种质可分为3个类群,并从中筛选6份种子产量特性差异大的蒺藜苜蓿种质作为杂交亲本,利用SSR、EST-SSR和SRAP引物检测亲本的多态性,发现6份亲本多态性差异明显;通过应用主基因+多基因遗传模型发现蒺藜苜蓿A17×A20组合的RILs群体种子产量性状的最佳遗传模型是2对加性-上位性主基因模型,该组合群体种子产量遗传以主基因为主,多基因遗传率较低,第二对主基因的加性效应值高于第一对主基因的加性效应值。     

蒺藜苜蓿SSR反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用

利用正交设计和完全随机试验优化蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn)SSR标记的PCR反应体系。结果表明,适合于一年生苜蓿(Medicago L.)遗传分析的SSR技术体系为:10μL反应体系中TaqDNA聚合酶为1U,dNTP浓度为0.20mmol/L,Mg²⁺浓度为2.0mmol/L,引物浓度为1.5umol/L,模板DNA用量为20ng/uL;利用该反应体系将2个蒺藜苜蓿亲本和杂交种有效鉴别;利用SSR标记对19个一年生苜蓿种质进行SSR-PCR扩增,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同种质间DNA谱带多态性丰富,通过UPGMA方法聚类分析可以明确区分19个一年生苜蓿种质。     

苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的分析

蒺藜苜蓿的基因组较小,遗传转化相对容易,是国际上广泛用于研究豆科植物的模式植物,其全基因组测序已经完成。WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子, 调节启动子中含W-box元件的调节基因和(/或)功能基因的表达, 从而参与植物的各种防卫反应。本研究以苜蓿基因组序列(Mt2.0)为材料,利用生物信息学方法分析苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的数目、种类、系统发生学、保守基序,结果表明,苜蓿中共有28个WRKY基因,其中5个基因含有2个WRKY结构域,共含有33个WRKY结构域,根据其结构域特点可以分为3个大类,同时与水稻WRKY基因进行了比较研究,发现基因数目远少于拟南芥和水稻,同时研究证实苜蓿与水稻WRKY基因的起源和进化关系存在较大差异,显示出苜蓿WRKY进化有其独特的特点,此外分析苜蓿WRKY基因的保守motif共有46个,筛选得到WRKY结构域的5个保守motif。该研究对苜蓿WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片衰老的转录组分析

为探究蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）叶片衰老过程中相关基因的分子机制及代谢通路,本研究以其成熟叶片和衰老初期、中期、末期叶片为研究对象。通过转录组测序,比较4个发育阶段样品之间的转录组差异。结果表明,与成熟叶片相比,共筛选出2 990个差异表达基因（DEGs）,在所有衰老样本中表达水平均发生显著变化,其中有2 684条（89.77%）可进行基因功能注释;同时利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果证实了转录组测序的可靠性。进一步分析发现,DEGs涉及高等植物转录因子33个家族,包括ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC和bZIP。此外,还发现了837个与叶片衰老相关的基因。本研究发现了蒺藜苜蓿叶片衰老过程中大量差异表达的基因,为进一步分析蒺藜苜蓿叶片发育和衰老的调控机制提供参考。