防治甜瓜枯萎病木霉菌REMI变异株筛选

采用平皿对峙培养的方法从本实验室构建的22株木霉菌REMI变异株及出发菌株T21中筛选出5株抑制率较高的木霉菌变异株,并进行了防治甜瓜枯萎病盆栽试验,最终筛选出2株防治效果较好的木霉菌变异株Ttrm42和Ttrm26,防效分别达到78.66%和74.67%。然后进行田间防效测定,防效分别达到78.05%和73.04%。研究结果表明,木霉菌REMI变异株可以提高对甜瓜枯萎病的防效。     

木霉REMI突变株主要生防酶活性改变及其基因部分序列差异的研究

本文探讨了来源于同一出发菌株木霉T21的不同木霉REMI突变株的主要生防酶活性的改变及其基因部分序列的差异,利用生化技术测定了木霉几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶酶活性,并对这两种酶的基因部分序列进行了分析.结果表明,木霉REMI突变株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化较大;相对于出发菌株T21,菌株Ttrm68和Ttrm31酶活性极显著高于出发菌株T21,而Ttrm94则极显著低于T21.采用简并引物克隆几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的部分序列,发现菌株Ttrm68、Ttrm31在几丁质酶基因中插入了GGTATCGATATCGAC片段,菌株Ttrm94在β-1,3-葡聚糖酶基因中插入了GTC片段.     

木霉菌REMI变异株与不同宿主的专化性互作研究

比较了木霉菌野生株及不同木霉REMI变异株与宿主植物间的相互关系。试验结果表明,供试木霉菌均不能促进黄瓜生长;Trm31对高羊茅草生长有抑制作用,其他菌株对高羊茅草生长无明显影响;T21、Trm47、Trm55对稗草的生长有促进作用,Trm31、Trm34对稗草的生长有明显的抑制作用。     

木霉菌对家蚕的安全性研究

木霉菌作为一种重要的植物病害生防菌被广泛用于作物病害生物防治。为了检测木霉菌对家蚕的安全性从而获得能够安全用于植物病害防治的生防木霉菌制剂,用对病害具有较好防治效果的木霉菌(Trichoderma viride)T23分生孢子悬浮液处理桑叶,饲喂家蚕幼虫,研究其对家蚕生长发育、生命力及茧质的影响。结果表明,木霉菌T23对家蚕各个龄期和全龄发育历期没有显著影响。饲喂添加木霉菌T23食料的家蚕幼虫发育历期为24.8 d,对照处理为24.5 d,两者存在一定差异,但未达到显著水平;对起蚕和熟蚕体重无显著影响;对全茧量、茧层量、茧层率和虫蛹统一生命率均无显著影响。     

木霉REMI转化体耐热机理的初步研究

本文利用蛋白质电泳、基因克隆和荧光定量PCR等技术对耐高温木霉REMI转化体的抗逆机理进行了初步研究。结果表明,耐高温木霉REMI转化体的蛋白质谱带明显多于出发菌株T21,且差异主要集中在Rf值大于0.593的区域,该区域主要是小分子的热休克蛋白,说明影响耐高温木霉REMI转化体对温度耐受性的蛋白主要以小分子量蛋白质为主。对其中一种热休克蛋白HSP24的基因进行克隆、测序,结果表明不同木霉REMI转化体和出发菌株T21间该基因序列没有差异,但经荧光定量PCR对HSP24基因转录检测表明,耐高温木霉REMI转化体的热激蛋白HSP24的表达量有所增加,从而表明REMI插入提高了该基因的转录水平。     

生防木霉菌Th2和T4对甜瓜根围土壤微生态的影响

利用平板计数、微生物量碳和末端标记限制性片段长度多态性分析(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)相结合的方法研究了2株生防菌哈茨木霉Th2和T4对甜瓜根围土壤微生态的影响.结果表明,生防菌Th2和T4对根围土壤细菌有明显的促生作用,而对真菌和放线菌有明显的抑制作用.T-RFLP数据统计学分析表明,Th2和T4的引入可以增加土壤细菌的多样性.其中对开花期土壤细菌菌群影响最显著,Th2对TRF251和TRF513菌群有显著的促生作用,含量是对照的3.7倍和4.5倍,T4对TRF251和TRF513菌群含量也比对照高4倍和5.6倍,而2株生防菌对TRF60菌群均有显著的抑制作用,其含量分别为对照的51.6%和64.3%.在果熟期生防菌对土壤细菌菌群的影响减弱,表明土壤的缓冲功能发挥了作用.研究结果还表明,Th2和T4对土壤细菌菌群有着相似的促生和抑制作用,且不会破坏土壤微生态的稳定性.     

三唑酮对西瓜根际木霉菌与尖孢镰刀菌竞争定殖的影响

 在尖孢镰刀菌厚垣孢子土中,接种1×10⁶cfu/g土的木霉菌孢子,并加入4~12μg/g土三唑酮。木霉菌加各三唑酮处理的尖孢镰刀菌厚垣孢子在西瓜根际的萌发率低于不加药的木霉菌对照,并与三唑酮剂量成反比;尖孢镰刀菌的根际竞争指数,以及在绝大部分根段根际的种群密度也低于不加药的木霉菌对照;而在上述条件下木霉菌的根际竞争指数以及在某些根段根际的种群密度十分接近或超过不加药的木霉菌对照。本文还讨论了不同木霉菌量和不同尖孢镰刀菌量条件下,三唑酮剂量对木霉菌和病原尖孢镰刀菌在西瓜根际竞争定殖的影响。     

棘孢木霉菌肥对黄瓜枯萎病的防治效果及对连作黄瓜根际土壤微生物种群的影响

为明确棘孢木霉Trichoderma asperellum菌肥在防治黄瓜枯萎病的同时对连作黄瓜根际土壤微生物种群的影响,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)和磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)分析方法分别测定了棘孢木霉菌肥对连作4年的黄瓜根际棘孢木霉菌和尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum DNA拷贝数变化和黄瓜根际微生物种群的影响。结果表明:棘孢木霉菌肥对黄瓜幼苗期和速长期黄瓜枯萎病的防治效果分别为70.24%和76.81%,均与药剂对照的防效差异不显著。棘孢木霉菌的DNA拷贝数出现2个高峰期,即黄瓜苗期和盛果期,其DNA拷贝数分别为235 000.00 ng/μL和80 500.00 ng/μL。黄瓜速长期、盛果期、生长末期的尖孢镰孢菌DNA拷贝数分别为15.41、54.87和18.36 ng/μL,且显著低于同一时期药剂对照和清水对照。黄瓜幼苗期、速长期、开花期和盛果期根际土壤微生物丰度分别为2.24、1.98、2.52和2.12,均高于药剂对照。由此可见,棘孢木霉菌肥在防治黄瓜枯萎病的同时,还可以改善黄瓜连作土壤微生物种群结构。     

木霉菌REMI转化体对番茄灰霉病的防治及其机理的研究

研究不同木霉菌转化体对番茄灰霉病防治效果及机理,为木霉菌生物防治的合理利用奠定基础。利用限制性内切酶介导基因整合技术(restriction enzyme-mediated integration,REMI),通过插入线性化质粒DNA获得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果优于出发菌T21菌株(出发菌)的3个木霉菌转化体Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55,对侵染花器和叶片的灰霉病防效分别比原生物防治木霉菌株提高了16.9%和8%。木霉菌转化体的产孢能力、分生孢子的萌发率、对碳氮源的利用能力及对高温的抵抗能力都有所提高;木霉菌转化体本身产生的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性均比出发菌高,因此通过REMI技术可以获得新的有益木霉菌转化体,在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。说明REMI技术可以用于改良生防木霉菌株的功能,提高生物防治效果。     

木霉对玉米纹枯病的生物防治

为明确木霉菌在玉米纹枯病防治上的作用,研究了从雅安郊区大田玉米根际土壤中分离到的18个木霉菌株对立枯丝核菌的抑制作用及对玉米纹枯病的田间防治效果.对峙培养结果表明,这些木霉菌株对立枯丝核菌的抑制率为39.44%～84.98%;而木霉发酵滤液的抑菌作用为13.48%～85.81%.对峙培养和液体发酵滤液的抑菌测定相结合,筛选出木霉菌株T8、T2、T13,经鉴定分别为哈茨木霉Trichoderma harzianum、黄绿木霉Trichoderma aureoviride和长枝木霉Trichoderma Longibrachiatum.用这3种木霉的固体培养物作进一步的田间防治试验,防治效果分别为62.75%、64.48%、68.52%,比井冈霉素(49.68%)效果高;T13菌株的发酵滤液的防治效果仅为40.07%.3株木霉固体培养物对玉米产量影响显著,增产率依次为29.77%、43.37%、54.21%.     

常用土壤杀菌剂和肥料对绿色木霉菌T23的影响

采用常规土壤微生物分离和真菌生物量测定等方法,检测6种常用土壤杀菌剂多菌灵、甲基托布津、福美双、代森锰锌、百菌清和五氯硝基苯;3种肥料尿素、过磷酸钙和硫酸钾;以及8种营养元素铜、锌、铁、钼、钙、锰、镁和钾对绿色木霉菌菌株T23菌丝生长、产孢及其在土壤中定殖的影响.不同杀菌剂、肥料和营养元素及其不同处理浓度处理对木霉菌株T23菌丝生长、产孢和定殖的影响差异显著,多菌灵和甲基托布津、尿素、硫酸锌和硫酸镁具有明显的抑制作用,20μg/mL多菌灵、甲基托布津原药对菌株123菌丝生长抑制率分别为100.0%和79.0%;0.23%尿素处理土壤21天后对根际定殖抑制率为35.6%;100mg/L硫酸锌和1000mg/L硫酸镁处理土壤21天后对木霉菌定殖的抑制率分别为31.1%和15.9%.适量应用代森锰锌、硫酸钾及二钼酸铵、硫酸钙、磷酸二氢钾等有利于木霉菌根际定殖.     

紫杉木霉菌株ZJUF0986原生质体的制备及诱变抗性菌株的选育

通过原生质体诱变,以目标代谢产物木霉菌素为抗性筛选标记选育木霉菌素高产菌株。紫杉木霉野生型菌株ZJUF0986在N15培养基中生长20h的菌丝体,用15mg/mL崩溃酶、30mg/mL蜗牛酶和30mg/mL溶壁酶组合成的混合酶为酶裂解液,以菌丝量∶ 酶裂解液=1∶ 2.5(w/v)的比例,在30℃、100r/min条件下酶解90min,原生质体释放量最佳,达到9.42×10⁸个/mL。所制备的原生质体进行氯化锂-紫外复合诱变,紫外照射剂量为60s时的突变率和正突变率最高,筛选到高产突变体菌株UL60-11,其发酵效价比野生型菌株提高67.3%。     

哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用对番茄灰霉病菌的增效机制

为验证哈茨木霉菌与啶酰菌胺联用对番茄灰霉病菌的增效作用,采用显微镜观察法观察了菌药联用后哈茨木霉菌和番茄灰霉病菌的菌丝形态,用菌丝生长速率法和圆盘滤膜法测定了菌药联用后哈茨木霉菌挥发性物质、非挥发性物质和粗酶液对番茄灰霉病菌的抑菌活性.结果显示:啶酰菌胺对哈茨木霉菌的菌丝基本无影响,但能使灰霉病菌的菌丝发生间断性溶解;菌药联用后哈茨木霉菌挥发性物质对灰霉病菌的最高抑菌活性为61.17％,而哈茨木霉菌和啶酰菌胺单独对灰霉病菌的抑菌活性分别为48.79％、0.97％,表现增效作用;菌药联用后哈茨木霉菌非挥发性物质和粗酶液对番茄灰霉病菌的抑菌活性未明显增强.研究表明,啶酰菌胺与哈茨木霉菌联用的增效机制是啶酰菌胺导致灰霉病菌的菌丝部分溶解,同时增强了哈茨木霉菌挥发性物质对灰霉病菌的抑菌活性.     

哈茨木霉对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用和抗性相关基因表达

采用室内筛选与田间防效相结合的方法,对哈茨木霉抑制黄瓜尖孢镰刀菌的拮抗机制进行了研究。对峙培养结果显示,木霉菌和病原菌间均形成了较明显的抑菌圈,对病原菌的抑菌率达66.7%~85.8%,其中菌株TG、TM对枯萎病菌抑制作用较强。木霉菌可有效提高根系对病原菌的抗性,黄瓜植株接种枯萎病菌后,根系细胞大量死亡,而先接种木霉菌再接种病原菌后则减小了对根系的伤害。田间防效试验结果表明,TG和TM孢子悬浮液浓度在108个/mL时防效最好,分别为54.9%和49.4%。接种木霉菌植株根系抗性基因的表达量均高于对照植株,呈双峰趋势。在第6天时抗性基因表达量最高,WRKY6、MYB、PR-1、PAL、GST和GLU的表达量分别为对照的5.15、5.22、6.07、6.00、3.16、和16.15倍。表明木霉菌通过激活与胁迫相关的基因表达提高了对病原菌的抗性。     

哈茨木霉Th-30几丁质酶的生产条件及对灰霉病菌的拮抗作用

病菌生长的抑制率为67.61%～71.31%,对灰霉病菌孢子产生及萌发的抑制率分别为80.95%和81.35%,对病菌孢子致病性的抑制率为65.22%～70.51%.     

长枝木霉对禾谷胞囊线虫卵的寄生和毒杀作用及其机制

为了明确长枝木霉Trichoderma longibrachiatum对小麦禾谷胞囊线虫Heterodera avenae卵的防治潜力和作用机制,在室内测定了长枝木霉分生孢子悬浮液对小麦禾谷胞囊线虫卵的寄生和毒杀作用,并通过温室盆栽试验测定了长枝木霉分生孢子悬浮液对小麦禾谷胞囊线虫卵的防治效果.室内试验中1.5×107 CFU/mL的长枝木霉分生孢子悬浮液处理12 d对小麦禾谷胞囊线虫卵的寄生率和卵孵化的相对抑制率分别为91.33％和88.35％.温室盆栽试验中1.5×107 CFU/mL处理对土壤中胞囊、线虫和根系中线虫的相对防治效果分别为89.84％、92.67％和88.30％;接种卵悬浮液和长枝木霉分生孢子悬浮液后,小麦幼苗株高、根系长度、地上部鲜重和根系鲜重的增长率分别为66.72％、159.31％、169.09％和170.19％;叶绿素总量和根系活力显著高于对照,分别为17.52 mg/g和356.25 μg·g-1·h-1.研究表明长枝木霉可作为小麦禾谷胞囊线虫的生防制剂.