水稻条纹病毒山东济宁分离物RSV-SD-JN2分子变异分析

为从分子水平探讨强致病性水稻条纹病毒山东济宁分离物RSV-SD-JN2的变异及其致病性,采用RT-PCR技术,克隆RSV-SD-JN2的RNA3、RNA4区段cDNA。结果显示,RSV-SD-JN2的RNA3和RNA4核苷酸序列长度分别为2487、2157bp;RNA3中,NS3基因长为636bp,基因间隔区(IR)为725bp,CP基因为969bp;RNA4中,SP基因长为537bp,基因间隔区(IR)为654bp,NSvc4基因为861bp。不同时期、不同区域和不同致病性的RSV分离物的序列比较发现,RNA3、RNA4序列5′和3′末端非编码区具有高度保守性,仅存在个别碱基的差异;基因编码区保守性较高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别在93%和97%以上,且大部分碱基变异为无意义变异;基因间隔区(IR)易于变异。RSV的分子变异与其地理分布具有密切的关系。RNA4的IR的变异导致RNA二级结构——发夹结构的稳定性提高是病毒致病性增强的重要原因。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

灰飞虱来源的水稻条纹病毒外壳蛋白基因遗传多样性

 采用单雌产卵法获得来自江苏、云南、山东、河北等地灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallén,SBPH）来源的21个水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）分离物,提取灰飞虱总RNA,经RT-PCR扩增,获得21个RSV分离物的包含外壳蛋白（cp）基因在内的约1 000 bp左右的DNA片段。测序结果显示,参试分离物的cp由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。采用DNASTAR软件进行分析,21个灰飞虱来源的RSV-cp核苷酸序列和推导出的编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为95.7%~100%和96.0%~100%。与已报道水稻来源的32个RSV分离物一起进行序列同源性比较和系统进化树分析结果表明,总体而言RSV-cp较为保守,其遗传多样性首先与地缘相关,从地理位置上可以分成中国云南、中国沿海和日本3个地理种群;其次与寄主相关,在同一地理种群中可以划分为灰飞虱和水稻2个寄主种群。     

小麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白(CP)基因序列的比较分析

 核苷酸序列分析结果表明,小麦黄色花叶病毒(W YMV)不同分离物的外壳蛋白基因存在一定的差异。邓州分离物CP基因在其31~33nt处均缺失了3个核苷酸,其余分离物与潢川分离物及日本分离物长度一致,均为882nt。不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为97.3%~98.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为97.6%~99.3%,外壳蛋白N末端的110个氨基酸和C末端的55个氨基酸在各个分离物间是高度保守的。潢川分离物有5个氨基酸与其它5个分离物明显不同。WYMV不同分离物外壳蛋白序列分析结果进一步确认了WYMV与WSSMV为Bymovirus属的2种不同病毒。     

粳稻品种对水稻条纹叶枯病的抗性鉴定及抗病品种镇稻88的遗传分析

采用田间小区鉴定方法研究27份粳稻品种对水稻条纹叶枯病的抗性表现,并在此基础上选择抗性表现强的镇稻88与高感品种武育粳3号构建F2分离群体进行遗传分析。结果表明,粳稻品种对水稻条纹叶枯病的田间抗性表现在不同年份和不同地区间存在一定的差异,但镇稻88、连粳4号、徐稻3号等9个品种在鉴定试验中均表现为抗病和高抗,可作为抗病品种在江苏地区推广应用。镇稻88与武育粳3号的F2群体抗感表型分离比例符合3∶1,表明镇稻88对条纹叶枯病的抗性受一对显性核基因的控制,将其作为抗病亲本使用可大大加快育种进程。研究同时发现在灰飞虱不引发虫害的条件下,有效接种虫量与感病对照发病率相关性达显著水平,当其值在0.8×106～3.6×106/hm2范围内时可作为水稻条纹叶枯病田间抗性鉴定有效的参考指标。     

烟草蚀纹病毒山东分离物全基因组序列的克隆和保守性分析

为利用RNA介导的病毒抗性策略,培育抗性稳定或抗多烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus,TEV）株系的转基因植株,采用RT-PCR及5＇-RACE方法克隆了烟草蚀纹病毒山东分离物TEV-SD1的全基因组序列。TEV-SD1全基因组核苷酸序列长度为9494 bp,包含1个9165 bp的开放阅读框架（open reading frame,ORF）,编码3054个氨基酸。将TEV-SD1基因组序列与GenBank中已公布的4个TEV全基因组序列和11个外壳蛋白（coat protein,CP）基因序列比对分析发现,各分离物CP基因间的核苷酸和氨基酸序列平均相似性分别为96.65%和98.31%,高于其它功能基因间的相似性;各分离物CP基因3＇端核苷酸序列相似性平均为96.55%,高于5＇端序列。聚类分析发现TEV在自然界中的分子变异与其寄主关系密切。     

番木瓜环斑病毒南瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒(Papayaring spot virus,PRSV)。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类,并为下一步转基因育种提供抗性基因,采用反转录PCR(RT-PCR)方法扩增了5个分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,番木瓜环斑病毒石屏分离物(PRSV-SP)和番木瓜环斑病毒蒙自分离物(PRSV-MZ)的CP基因长873nt,编码290个氨基酸,番木瓜环斑病毒峨山分离物(PRSV-ES)、番木瓜环斑病毒版纳分离物(PRSV-BN)和番木瓜环斑病毒宾川分离物(PRSV-BC),3个分离物CP基因长867nt,编码288个氨基酸。PRSV5个分离物核苷酸序列的同源性在94%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。与国内外17个分离物相比,核苷酸序列同源性为89.6%~98.7%,氨基酸序列同源性为86.5%~99.6%。其中PRSV-SP和来自于越南分离物PRSV-V47无论是核苷酸序列,还是氨基酸序列同源性都达到了最高,而5个分离物与来自于巴西(PRSV-BR)、美国(PRSV-USA)、墨西哥(PRSV-Y)核苷酸序列同源性均低于90%。     

甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备

 甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT-PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,cp基因全长900 bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物cp基因的核苷酸序列一致性为78.3%～89.9%,推导的氨基酸序列一致性为91.3%～95.7%,存在较大的分子变异。不同分离物CP氨基酸序列N末端的第3-32位氨基酸为多变区。将四川分离物的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,cp基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPCFV CP的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清效价达1∶128 000,可用于田间甘薯样品的检测。     

河南省地黄病毒病初步鉴定

 利用血清学、RT-PCR并结合核苷酸序列测定等方法,对河南省地黄病毒病进行了初步鉴定。结果表明,烟草花叶病毒(TMV)为侵染地黄的主要病毒;对TMV地黄分离物(TMV-RH) CP基因的序列分析结果表明,TMV-RH与TMV-U1株系CP基因的核苷酸同源性为86.5%,氨基酸同源性为94.3%;与已发表的TMV其它株系CP基因的核苷酸同源性在76.3%~88.5%之间,氨基酸同源性在79.3%~95.0%之间,同源性较低。根据不同株系CP的氨基酸序列进化树分析,推测该分离物可能为TMV的一个新株系。     

华东地区水稻品种条纹叶枯病抗性鉴定

为了丰富水稻条纹叶枯病的抗性资源和加快条纹叶枯病抗性品种培育,对69份来自华东及华南地区的籼粳不同亚种材料,在浙江、江苏两地进行苗期人工接虫和大田自然诱发筛选条纹叶枯病抗性资源.11份材料表现出较好的条纹叶枯病抗性,抗性水平与目前华东地区广泛利用的抗源镇稻88相当,且抗性表现为显性遗传.分子标记鉴定发现,其中3份材料与镇稻88抗性位点一致,而其余材料与镇稻88不同.这些抗性材料育成的后代抗性好、产量高,是培育江浙沪等晚粳稻区条纹叶枯病抗性品种的优质亲本.     

沿黄稻区水稻品种对水稻条纹叶枯病抗性评价

2007年和2008年在田间自然发病条件下, 鉴定了河南省沿黄稻区25个主要推广品种、育种高代品系对水稻条纹叶枯病的抗性。结果表明,在两个年份均表现为抗病的有5个粳稻（5/17）、3个籼稻（3/3）和2个旱稻（2/5）品种;但有4个品种（4/25）表现不一致。2007年17个粳稻品种中的11个表现为感病或中感（64.70%）,5个旱稻品种中2个表现感病或中感（40％）。2008年17个品种中有10个表现为感病或中感（58.80%）,5个旱稻品种中3个表现为感病或中感（60％）。 2008年对25个品种的病情变化和田间灰飞虱种群动态的调查结果表明,抗、感品种间的病情变化具有明显的差异,不同水稻品种间灰飞虱的虫口数量也具有显著的差异,但品种对水稻条纹叶枯病的抗性程度和灰飞虱的虫口数量并不完全一致。     

水稻条纹病毒不同地区分离物的致病性研究

 利用36个粳稻品种对来自江苏、云南、河北、山东等地的22个水稻条纹病毒(RSV)分离物进行致病性测定,根据各分离物在36个品种上的平均发病率,将参试分离物划分为HV、SH、MV、SL和LV 5个致病类型,致病力强弱为HV > SH > MV > SL > LV,其中MV和SL型占77%,表明RSV对粳稻的致病力中等偏弱。各致病型在地区间和年度间呈随机分布状态,暗示自然条件下特定地区的RSV为混合致病群。根据致病性测定结果同时将36个粳稻品种划分为免疫、抗、中抗、中感、感和高感6个抗感类型,其中中感和感病类型占70%,无高感和免疫类型,显示粳稻对RSV比较敏感但有一定程度的耐受性。根据试验结果筛选出11个具有鉴别能力的水稻品种,可对RSV分离物进行致病型鉴定。研究发现部分抗病品种对一些分离物表现为中抗~中感类型,接种量加大时可转为感病类型,由此提示各地在应用抗病品种防治水稻条纹叶枯病时应根据当地RSV致病型的差异,针对性地选用抗病品种,当灰飞虱超量发生时需及时做好治虫控病工作,并随时监测当地RSV致病型的变化,警惕品种抗性丧失。     

早稻品种对条纹叶枯病的田间抗性及病害侵染梯度

针对安徽及周边地区近年来水稻条纹叶枯病大流行,以及给水稻生产带来的巨大损失,本研究以安徽地区生产上常用的16个早稻品种为材料,自然诱发探讨了不同水稻品种对条纹叶枯病的抗性,结果表明:供试16个早稻品种对条纹叶枯病的抗性可初步分为高抗、中抗和中感3个类型。其中高抗品种为‘Z7333’、‘Z7332’、‘YK19’、‘中香1号’,中抗品种为‘中早33’、‘浙辐001’、‘中早25’、‘优04-309’、‘Z5320’、‘早籼788’、‘早籼2430’、‘中基2号’、‘Z04-309’、‘Z04-113’、‘Z5317’,中感品种为‘浙辐203’。在灰飞虱成虫带毒率16.95%的基础上,调查了水稻品种‘武育粳3号’条纹叶枯病发病率与灰飞虱虫量的关系,水稻条纹叶枯病发病率与灰飞虱虫量呈显著的正相关;条纹叶枯病发病率(y)与灰飞虱虫量(x)的线性方程为:y=6.001 4+0.021 6x(R2=0.989 3*)。以离田埂距离x为自变量,发病率y为依变量,组建病害梯度曲线模型为y=0.636 103+43.557/x(R2=0.996 8)。     

331份四川小麦品种(系)在甘肃陇南抗条锈性表现及利用价值

2014年-2017年度先后对331份四川省小麦生产品种(系)在温室进行苗期人工接种条锈菌混合菌鉴定和甘谷试验站大田成株期分别接种CYR32、CYR33、CYR34、G22-14、中4-1和混合菌鉴定,同时在甘谷试验站和汪川良种场两地进行自然诱发鉴定。结果发现:在人工接种条件下,苗期、成株期表现抗病的分别有‘XK201465’等36份和‘XK20132’等72份材料,分别占10.88%和21.75%;有‘XK62483’等11份材料全生育期表现抗病,占3.32%;两地三年自然诱发鉴定发现,仅有‘XK20132’等5份材料在两地均表现抗病,有‘川农17’等30份材料具有慢条锈性。对供鉴材料在甘肃陇南的利用前景进行了分析。     

水稻稻瘟病抗性QTL的定位分析

 稻瘟病是危害水稻最严重的病害之一。以抗稻瘟病的云南省地方品种魔王谷（MWG）和感稻瘟病的湖北省审定品种鄂晚8号（EW8）为亲本材料,构建双单倍体分离群体（DH）。利用22个菌株对亲本材料MWG/EW8进行致病性鉴定,从中筛选到5个毒性不同的鉴别菌株用于考察DH群体的稻瘟病抗性,构建包含120对SSR标记的分子遗传连锁图进行数量性状位点（QTL）的分析,鉴定出3个抗性QTL,均位于第6染色体长臂RM541附近, 3个QTL对抗病表型的贡献率介于7.7%~15.2 %之间,3个QTL的抗病等位基因均源自亲本MWG。     

一种适合水稻农杆菌转化的RNAi载体的构建和潮霉素对水稻转化的影响

以感染水稻条纹病毒(RSV)水稻叶片的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增出了RSV的CP基因。分别将正反向的CP基因连接到载体pMCG161,再将此载体和pCAMBIA1301载体同时双酶切,产物回收后连接,成功构建了适合农杆菌介导的水稻转化RNAi载体。在农杆菌水稻转化过程中,比较了分化阶段是否加潮霉素对愈伤组织分化的影响,结果表明,分化阶段去除潮霉素的筛选可以提高愈伤组织的分化程度但同时降低获得水稻植株的阳性率。     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA1片段序列比较

 首次测定了我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的RSV 2个分离物RNA1片段的全长序列,这2个分离物RNA1片段的全长序列均为8970 nts。同源性分析结果表明,HZ与日本T分离物的亲缘关系较CX与T分离物的亲缘关系更为接近。通过对纤细病毒属病毒RNA1编码的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)氨基酸序列分析的结果表明,该蛋白除了具有RNA聚合酶特征的基元序列结构外,还存在mRNA的转录过程中所采取的加帽起始机制的保守性结构域位点,这表明,纤细病毒属病毒和布尼安病毒科病毒及甲型流感病毒一样,都是采取加帽起始机制进行转录的。     

水稻条纹病毒分子生物学研究进展

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)是最重要的水稻病毒之一,给水稻生产造成了严重损失。它隶属于纤细病毒属,是该属的典型成员。其基因组由4条单链负义RNA基因组片段组成,根据序列分析和试验证据推测共可编码7个病毒蛋白。围绕近年来国内外有关RSV粒子特点、基因组和病毒蛋白的研究进展作一简要综述,并提出了RSV研究过程中涉及到的一些问题。