小麦白粉病菌基因组DNA的微量提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为了寻找适合小麦白粉菌基因组DNA微量提取的方法,本试验利用改进的CTAB法、电钻微量研磨一管法、FastPrep DNA试剂盒法和Chelex-100法分别提取小麦白粉菌基因组DNA。比较得出,在微量提取时,CTAB法的提取率较高;在分生孢子量较多时,FastPrep DNA试剂盒方法提取的DNA质量较高,这两种方法提取的DNA均适用于ISSR-PCR。采用正交设计L16(45)法优化了适合于小麦白粉病菌群体的ISSR体系,确定了25μL时优化的反应体系:1×buffer、模板DNA0.5ng、dNTP0.14mmol/L、TaqDNA聚合酶1U、引物1.4μmol/L、Mg2+1.8mmol/L。利用该体系筛选出了一批多态性较好的ISSR引物,为小麦白粉病菌遗传多样性研究奠定了基础。     

河南省西部山区小麦白粉菌群体遗传多样性分析

为揭示河南省小麦白粉菌群体遗传结构、起源及进化关系,采用简单重复序列区间(inter-simple sequence repeats,ISSR)和扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记技术对河南省西部山区4个小麦产区的35个小麦白粉菌单孢分离菌株进行了群体遗传多样性分析。结果显示:ISSR和AFLP分析均将35个菌株分为3个组,组Ⅰ包括来自卢氏和灵宝的大部分菌株;组Ⅱ包括来自栾川、卢氏和巩义的菌株;组Ⅲ由4个地区的个别菌株组成,同时包含1个闭囊壳释放子囊孢子获得的菌株。ISSR分析出菌株遗传距离分布在0.0139～0.6592之间,扩增多态性比率为64.83%,各菌株间的Shannon指数为0.2749;而AFLP分析所得的各菌株遗传距离变化幅度在0.1257～0.9322之间,扩增多态性比率为82.68%,各菌株间的Shannon指数为0.5100。可见,河南省小麦白粉菌具有丰富的遗传多样性,研究所用的2种方法均可用于遗传多样性分析,其中AFLP分析小麦白粉菌群体表现出更为丰富的遗传多样性。     

棉花黄萎病菌ISSR反应体系优化及其遗传多样性分析

为给棉花黄萎病菌分子变异及遗传多样性研究提供可靠的检测方法,以棉花黄萎病菌基因组DNA为模板,采用正交优化方法对PCR体系中DNA聚合酶、引物、dNTPs、DNA模板、Mg2+及10×Buffer等重要参数进行6因素4水平优化,建立了棉花黄萎病菌ISSR-PCR优化反应体系,并从20条ISSR通用引物中筛选出多态性较好的10条引物。采用该优化反应体系和10条ISSR引物对采自陕西棉花主产区的21个棉花黄萎病菌菌株和3个参照菌株进行ISSR分析。结果显示,10条ISSR引物共扩增出87条谱带,条带分子量均在250~2 000 bp之间,平均每条引物扩增出8.7个条带,其中58条为多态性条带,占65.2%。聚类分析结果显示,在相似系数0.59处,供试菌株分为2个遗传类型。表明棉花黄萎病菌菌株间的亲缘关系与地理来源存在一定的相关性,而与其病害症状类型无相关性。     

玉米大斑病菌ISSR反应体系的优化和遗传多样性分析

以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,采用单因素水平优化的方法对DNA聚合酶的来源及浓度、引物浓度、dNTPs浓度、DNA模板浓度、Tm(退火温度)、PCR反应循环数等重要参数进行摸索和优化,建立了玉米大斑病菌ISSR-PCR优化反应体系,并从40条ISSR引物中筛选出9条多态性较好的ISSR引物。对来自河北、河南、辽宁等玉米主产区的44个菌株进行ISSR分析表明,ISSR标记在我国玉米大斑病菌中存在较高的多态性,多态性条带占40.3%。聚类分析显示,在阈值为0.8时菌株被分为7个类群。对ISSR揭示的玉米大斑病菌的遗传多样性与菌株交配型、地理来源之间的关系进行分析,结果显示菌株的遗传多样性与交配型间的关系密切,而与其地理来源无明显相关性。     

利用UP-PCR、ISSR和AFLP标记分析玉米丝黑穗病菌遗传多样性

利用UP-PCR、ISSR和AFLP分子标记方法研究了我国主要玉米产区34株玉米丝黑穗病菌的遗传多样性。从供试引物中筛选获得具多态性的UP-PCR引物9个、ISSR引物11个和AFLP引物组合22对,分别扩增出113、72和293条谱带,多态性条带比率分别为91.15%、84.7%和83.27%。聚类分析表明,玉米丝黑穗病菌存在丰富的遗传变异,与地理来源无明显相关性。3种分子标记的遗传相似系数矩阵相关性分析表明,UP-PCR与AFLP具有较高的相关性,相关系数为0.698;UP-PCR与ISSR、ISSR与AFLP的相关系数分别为0.659和0.633。从多态性水平、稳定性和可操作性可以看出,UP-PCR技术更适于分析玉米丝黑穗病菌遗传多样性。此外,UP-PCR、ISSR和AFLP标记划分的类群与鉴别寄主划分的致病类型之间存在一定的相关性,吻合率分别为50.0%、60.0%和47.6%。     

马铃薯早疫病病菌ISSR-PCR反应体系优化

为了应用ISSR分子标记技术分析马铃薯早疫病病菌遗传多样性,采用单因素水平对影响ISSR反应的Mg~(2+),d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度及引物退火温度等条件进行了优化,建立了适宜于早疫病病菌的ISSR最佳反应体系。25μL的反应体系中,Mg~(2+)2.0 mmo1/L,d NTPs 0.15 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.75U,引物0.40μmol/L;从30条ISSR引物中筛选出10条多态性较好的ISSR引物,并确定了各条引物的退火温度。结果为应用ISSR分子标记技术研究马铃薯早疫病病菌遗传多样性奠定了基础。     

山东小麦白粉病菌的毒性监测及遗传多样性分析

<正>小麦白粉病在山东各麦区均有发生,一般造成减产10%~50%,严重制约小麦高产。小麦白粉菌群体的研究常采用毒性鉴定法,通过病原菌对不同抗病基因的毒性频率来监测群体毒性的变异(段霞瑜等,1998)。但寄主对相应毒性基因具有选择性,仅凭毒性频率揭示病菌群体结构存在局限性,而ISSR标记可快速高效地检测出基因组DNA的多态性。贾少锋等(2007)首次构建了小麦白粉菌的IS-     

我国烟草赤星病菌遗传多样性的ISSR分析

为明确我国烟草赤星病的2种主要致病菌链格孢菌Alternaria alternata和长柄链格孢菌A.longipes的地理差异与遗传结构,采用ISSR标记对分离自9个省市的135株烟草赤星病菌进行遗传多样性分析。结果显示,通过正交优化试验建立的烟草赤星病菌ISSR-PCR最佳反应体系稳定性较好,筛选出17条多态性高且稳定的引物,共扩增出192条谱带,其中有177条具有多态性,多态率为92.19%。UPGMA聚类分析结果显示,链格孢菌和长柄链格孢菌的遗传相似性系数分别在0.67~1.00和0.66~1.00之间,遗传相似性系数为0.83时可使链格孢菌和长柄链格孢菌分别划分为5个和6个亚群,其中前者不同地理种群间表现出地理相关性,后者不同菌株随机分组。烟草赤星病菌种群的基因多态性和遗传多样性丰富,链格孢菌和长柄链格孢菌的群体间遗传分化系数分别为0.36和0.37,均存在遗传分化;群居每代迁移数分别为0.89和0.85,不同地理种群间存在基因交流;2种烟草赤星病菌的遗传分化结构表现出相似性。表明我国烟草赤星病菌中的链格孢菌和长柄链格孢菌均存在丰富的遗传多样性,且二者进化方向相似,ISSR标记能较好地揭示烟草赤星病菌种群间的亲缘关系和遗传差异性,可用于其遗传多样性分析。     

利用AFLP分子标记和无毒基因构建小麦白粉菌遗传连锁图谱

 本研究以具有8个无毒基因差异的2个小麦白粉菌亲本菌株CPW-1和E17进行杂交,获得97个后代菌株。以此为材料,利用AFLP分子标记的方法,对小麦白粉菌亲本及其杂交后代群体进行多态性分析,应用MAPMAKER/EXP(3.0b)并结合MapDrawV2.1软件构建小麦白粉菌的遗传连锁图谱。该图谱有10个连锁群,含117个标记位点(5个无毒基因位点和112个AFLP位点),总长1425.1cM。此图谱为首个在小麦白粉菌中构建的具有117个位点的遗传连锁图谱,而且首次获得了与无毒基因紧密连锁的AFLP分子标记位点。这些工作为无毒基因的定位和克隆、为全面进行小麦白粉菌的遗传学研究奠定了基础。     

基于ISSR标记开发的一种用于小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法

 小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn, 简称TCK)是小麦上的一种重要检疫性真菌。本研究利用内部简单重复序列(Inter-simple sequence repeat, ISSR)技术研究TCK及其近缘种的DNA多态性,开发了一种可靠而简单的方法用于TCK的分子鉴定。用ISSR引物P4从TCK中扩增出一条1 113 bp的特异性条带,据此设计了一对特异性引物TCKF/TCKR,在12个TCK菌株中均能扩增得到一条882 bp的特异性条带,而其他近缘种包括小麦网腥黑穗病菌(T. caries)和小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)及相关黑粉菌的14个菌株均无扩增条带。用该特异性引物检测TCK的下限为25 μL反应体系中可检测到1 ng DNA模板。本研究开发的种特异性引物,可将TCK与其形态上相似的近缘种尤其是小麦网腥黑穗病菌准确区分开,本研究基于ISSR标记建立的小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法为腥黑粉菌的检疫提供了一种便捷的方法,是对现有分子鉴定方法的一个补充。     

牛筋草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以牛筋草地上组织为材料,采用正交优化和单因子试验两种方法对影响牛筋草ISSR-PCR体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度和DNA模板浓度5个因素进行优化试验,建立适合牛筋草ISSR-PCR的反应体系.结果表明,牛筋草ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:Mg2+1.75 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1 U/25 μL,引物0.3μmol/L,模板DNA 80 ng/25μL,10×PCR Buffer 2.5 μL/25 μL.利用优化体系进行牛筋草的ISSR-PCR反应,可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果.     

抗苯醚菌酯(ZJ0712)小麦白粉病菌突变体的诱导及其生物学特性

经过药剂驯化10代后,从对苯醚菌酯(ZJ0712)敏感的小麦白粉病菌Blumeria graminis f.sp.tritici 3个菌株中获得3个抗药突变体,突变体的抗性指数均大于80,且其抗性能够通过无性繁殖稳定遗传。室内接种试验发现,突变体的致病力与亲本菌株无明显差异。细胞色素b (cyt b)基因片段序列分析发现,突变体cyt b基因的第143位密码子均由敏感菌株的GGT(丙氨酸)突变成了GCT(甘氨酸)。研究结果表明,小麦白粉病菌对苯醚菌酯存在较高的抗性风险,该药剂在使用过程中需注意采取相应的抗性治理措施,以延缓抗性发生。     

Clavibacter michiganensis subsp. michiganesis: Tracking strains using their genetic differentiations by ISSR markers in Southern Turkey

There is no available data published related to the dissemination of bacterial canker caused by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm) and its genetic diversity in Turkey. It is important to control new introduced inoculum sources by commercial seeds and seedlings. Pathogens were identified by morphological features and the identity was confirmed by PCR amplification using a specific primer PSA-4, PSA-R in addition to microbiological tests. ISSR markers showing high polymorphism ratios were selected and used to characterize Cmm strains. The collected strains were classified into different groups on the basis of ISSR-PCR fingerprints, which showed remarkable genetic specificity and diversity not previously identified in Cmm, suggesting that genetic differences are related to dissemination of the pathogen in the region. This is the first ever study carried out on the characterization of Cmm using ISSR. The selected ISSR primers to characterize Cmm can be used to determine genetic differences in further studies.     

Genetic variation among asexual progeny of Phytophthora infestans detected with RAPD and AFLP markers

Genotypic variation among 32 single-zoospore isolates (SZI) of Phytophthora infestans , derived asexually from two hyphal-tip parental isolates (PI-105 and PI-1) of the US-8 genotype, was assessed with 80 random amplified polymorphic DNA (RAPD) primers and 18 amplified fragment length polymorphic DNA (AFLP) primer pairs. In previous investigations, the SZIs from parental isolate PI-105 showed high levels of virulence variability and were differentiated into 14 races, whereas the SZIs from PI-1 showed identical virulence to the parent. The purpose of this investigation was to determine if phenotypic variation observed among SZIs of P. infestans could be detected at the DNA level in these isolates. Polymorphism was detected with 51 RAPD primers and with all 18 AFLP primer pairs in PI-105 SZIs. In SZIs from PI-1, polymorphism was also detected with 25 RAPD primers and 17 AFLP primer pairs. Cluster analysis using the unweighted pair-group method with arithmetic averages (UPGMA) separated the SZIs from parent PI-105 into six virulence groups, 11 RAPD groups and three AFLP groups. Cluster analysis of PI-1 SZIs, which all belong to the same virulence group, differentiated them into four RAPD groups and six AFLP groups. No close correlation among RAPD, AFLP and virulence groups could be established within the two progenies of SZIs. Results of this study suggest that there is a considerable level of inherent genetic variability among SZIs derived asexually from the same parental isolate. The possible mechanisms and implications of this genetic variation are discussed.     

小麦白粉病菌对喹氧灵和苯菌酮的敏感基线及药剂的生物活性

采用离体叶段法,分别测定了从河北、河南、湖北、陕西和四川5省分离的53个小麦白粉病菌单孢菌株对苯菌酮和喹氧灵的敏感性,并分析了白粉病菌对三唑酮和苯菌酮以及喹氧灵之间的 交互抗性。结果表明:小麦白粉病菌群体对苯菌酮和喹氧灵的平均EC50值分别为(0.001 9±0.000 6) 和(0.013 1±0.002 0) mg/L,苯菌酮比喹氧灵具有更高的抑菌活性;小麦白粉病菌对三唑酮和苯菌酮与喹氧灵之间均不存在交互抗性(R2值分别为0.102 6和0.491 9);室内盆栽试验结果显示:接种前1 d和接种后1d施药,苯菌酮和喹氧灵对小麦白粉病的保护与治疗作用防效分别为92.21%、84.25%和82.43%、70.25%,表明这2种药剂不仅具有优异的保护作用,同时还具有较好的治疗作用。     

黄瓜枯萎病菌毒力、营养体亲和性及ISSR分析

 本研究对来自哈尔滨、长春、沈阳、北京、西宁5个城市的70个尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌株进行了毒力、营养体亲和性及ISSR分析。毒力测定结果显示黄瓜枯萎病菌在东农803品种上存在明显的毒力分化。在营养体亲和群的测定中有8个菌株没有产生nit突变体,2个菌株经测定为异核体自身不亲和性菌株,不能进行营养体亲和群的测定;其余60个菌株可分为5个营养体亲和群。利用筛选的7个引物对70个菌株进行了ISSR分子标记,聚类分析可将70个菌株分为3个类群,其中IGⅠ的41个菌株均来自东北三省,IGⅡ的21个菌株均来自北京,IGⅢ的8个菌株全部来自西宁。VCGs和ISSRs与菌株的地理来源及毒力存在一定的相关性。     

猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究

 猕猴桃溃疡病是猕猴桃生产上的主要病害,为建立该病的快速诊断技术,本实验通过RAPD分析获得一条1 300 bp左右的致病菌的特异片段,对该片段进行克隆测序,在测序的基础上设计并合成一对特异引物F7/R7,优化特异引物扩增条件,并验证引物的特异性和灵敏性。利用该特异引物对包括猕猴桃溃疡病菌在内的14个菌株基因组DNA进行PCR扩增表明,只有猕猴桃溃疡病菌能扩增出1条约为950 bp的特异条带,其他菌株及对照均未扩增出特异条带。对采自果园的染病枝干组织和接种致病菌的枝干组织的检测表明,该特异引物能特异性地检测到猕猴桃溃疡病菌的存在,其在组织中的检测灵敏度为100 fg/μL。因此,利用设计合成的特异引物F7/R7,参考优化的体系和程序,结合简单的试剂盒法提取猕猴桃溃疡病菌或植物组织DNA,可以在短时间内完成对该病原菌的分子检测。     

陕西省小麦白粉菌群体毒性结构及遗传多样性

为明确近年来陕西省小麦白粉菌Blumeria graminis f. sp. tritici群体毒性及遗传变异情况,利用32份已知抗白粉病基因小麦品种(系)对2013年和2014年陕西省小麦白粉菌群体毒性结构进行测定,并应用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记对2014年陕西省西安市、咸阳市、渭南市、宝鸡市及陕西省毗邻的甘肃省天水市5个小麦白粉菌地理群体共118株白粉菌菌株进行遗传多样性分析。毒性监测结果显示,供试小麦白粉菌群体对Pm1c、Pm2、Pm3d、Pm4a、Pm4b、Pm5b、Pm13、Pm21、Pm24、Pm30、Pm2+6、Pm2+Mld、Pm2+6+?、Pm4b+5b、Pm4+?、Pm5+6的平均毒性频率在0～17.23%之间,表明这些基因抗性保持较好;对Pm1a、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm7、Pm8、Pm19、Pm1+2+9的平均毒性频率介于69.17%～99.60%之间,表明这些基因抗性已丧失。用筛选出的6对AFLP标记共扩增出831个多态性位点,多态性位点百分比为94.86%;小麦白粉菌群体遗传多样性指数和香农信息指数分别为0.1151和0.2036,遗传变异主要来源于群体内变异。群体间基因流为4.7939,表明5个小麦白粉菌群体间基因交流广泛。群体间遗传距离和地理距离两者显著正相关。     

Rep-PCR技术对中国水稻条斑病菌的遗传多样性初析

 采用Rep-PCR技术,对30个水稻细菌性条斑病菌株(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)进行遗传多样性分析,同时对李氏禾条斑病菌等其它10个参试菌株也进行了比较。Rep-PCR是利用一些基于细菌的短的重复序列引物(ERIC和BOX)的DNA扩增特性,2种引物组合的电泳图谱结合并分析,以水稻细菌性条斑病菌各自的指纹谱型在相似率80%时可分为6簇,初步表明我国水稻细菌性条斑病菌群体的遗传分化明显;发现自然界存在的弱或无毒性菌株与毒性菌株的Rep-PCR指纹图谱差异很大;毒性菌株的遗传分簇与其致病性具有一定的相关性。用ERIC扩增水稻条斑病菌基因组DNA的指纹比BOX更为多样,两者对菌株的分辨率不同。因此,Rep-PCR技术可有效地用于监测水稻细菌性条斑病菌的遗传变异,还可应用于菌株的鉴定和分类学研究。