鸡β-防御素CDNA的克隆与序列分析

使用总RNA提取试剂盒,从1月龄粤黄鸡骨髓细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-2)cDNA片段.PCR产物经凝胶回收纯化,加A尾后与载体pGEM-T Easy相连,然后转化感受态细胞DH-5α在含X-gal、IPTG的LA平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与提取质粒作限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序.结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为195bp,用Blast程序进行检索比较表明此扩增序列与Genbank中发表的鸡Gal-2 cDNA编码区序列100%相同.该cDNA编码64个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由36个氨基酸残基组成.     

鸡β-防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

鸡β-防御素是一类广谱抗菌阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal-2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM-TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM-T-Gal-2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL-c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL-c2x-Gal-2重组质粒。     

驯鹿β-防御素-1 cDNA 3’末端的克隆及序列分析

为进一步研究驯鹿伊防御素-1（reBD-1）基因的分子结构，利用已克隆出的reBD-1部分片段，设计了1条特异性上游引物，并以反转录引物中的部分序列即3sites Adaptor Primer作为下游引物，采用3’RACE技术成功克隆了reBD-1 cDNA的3’末端序列。通过与已知reBD-1片段拼接，得到了192bp的完整开放读码框（ORF）、终止密码子TAA、118bp的3’非翻译区（3’UTR）以及poly（A）1S,其中ORF编码具有64个氨基酸残基的reBD-1前原肽。     

滩羊β-防御素基因的克隆和表达

选取滩羊β-防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的黏膜组织,提取组织总RNA,RT-PCR获得滩羊β-防御素基因全序列.构建逆转录病毒表达载体,实现滩羊β-防御素基因的表达.经测序后得到滩羊β-防御素编码区的核苷酸序列(64个氨基酸).成功构建了带有滩羊β-防御素基因的逆转录病毒载体pLEGFP-SBD,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白,并用SDS-PAGE方法检测到分子量约为8 kD的目的蛋白.该蛋白具有抗细菌和抑制VSV病毒增殖的活性.     

鸡β-防御素-1cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

从鸡骨髓细胞中分离提取总RNA，经过反转录PCR（RT-PCR）扩增出鸡β-防御素-1（Gallinacin-1，Gal-1）cDNA，将扩增产物与pGEM—T Easy载体相连，经克隆测序表明扩增出的cDNA碱基数为198bp，与报道的Gal—1cDNA编码区碱基序列完全相同。分析核苷酸序列表明Gal-1与火鸡异嗜性白细胞肽-1（Turkey heterophil peptides，THP-1）具有85．4％同源性。氨基酸序列方面Gal-1与THP-1同源性最高，为72．7％。将Gal-1基因成熟肽片段插入到酵母表达载体pPIZα-C，构建重组表达载体pPICZα-C-gal-1，电转入表达宿主菌X-33，Zeocin抗性筛选重组菌株。挑取阳性菌株经甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳发现在约4．5ku位置出现预期条带。对其抗菌活性检测发现具有抗大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌的活性。反相高效液相色谱表明阳性菌株表达产物与标准品在层析柱中保留时间一致。     

鸡β-防御素-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定

采用RT-PCR方法从鸡外周血淋巴细胞中扩增鸡β-防御素-3成熟肽基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A的分泌信号肽基因下游.线性化后的重组质粒电击转化毕赤酵母宿主菌GS115,经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后,得到重组酵母菌.阳性转化菌经甲醇诱导后,SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明,在毕赤酵母中得到分泌性表达产物,分子量约为8.9 ku,活性检测表明其具有显著的抑菌活性.     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

鸡β-防御素Gallinacin-8基因片段的克隆与序列分析

本试验从鸡的肝脏中提取总RNA,根据GenBank公布的鸡β-防御素Gallinacin-8(简称gal-8)基因序列设计2对引物,运用RT-PCR技术扩增出大小为20lbp的鸡β-防御素gal-8的基因片段.通过序列分析得知其由66个氨基酸组成,包括20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片肽及41个氨基酸的成熟肽.BLAST分析表明与GenBank中已公布的序列相比较缺失2个碱基,其同源性达到98%.将该基因克隆进pGEM-T Easy载体中,并转化大肠杆茵感受态DH5α,经筛选和测序鉴定获得了阳性重组质粒.从重组质粒中扩增出的成熟肽,大小约123 bp.试验为进一步构建重组核蛋白及表达具有广谱抗微生物活性的防御素提供了实验基础.     

广西黄鸡β-防御素Gal-4基因的克隆和体内诱导表达

采用RT-PCR方法从广西黄鸡骨髓中扩增了β-防御素Gal-4基因的cDNA片段。序列分析结果表明，获得的广西黄鸡Gal-4基因大小为321bp，推导的Gal-4由63个氨基酸组成，其中N端20个氨基酸为信号肽，C端38个氨基酸组成Gal-4的成熟肽。另外，分析了Gal-4基因在正常广西黄鸡（对照组）和H9N2禽流感病毒感染的广西黄鸡（感染组）的肺、肝、腔上囊、十二指肠、肾、气管组织中的表达情况。分析结果表明，在检测的6个组织中，肺、十二指肠、肾组织Gal-4基因的表达在感染组和对照组之间没有明显的差别，而在肝、气管和腔上囊组织中的表达有明显差异，感染组比对照组的Gal-4阳性样品数多。在肝组织中，对照组的30个样品检测到26个阳性样品，而感染组的30个样品全都是阳性；在气管组织中，对照组30个样品检测到19个阳性样品，而感染组的30个样品检测到24个阳性样品；在腔上囊组织中，Gal-4基因的诱导表达情况非常明显，对照组30个样品中仅有9个阳性，而感染组的30个样品中有21个阳性。     

安徽三黄鸡β-防御素Gal-6cDNA基因片段的克隆与序列分析

根据基因库中鸡β-防御素Gal-6cDNA基因序列设计2对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从安徽三黄鸡白细胞RNA中扩增了β-防御素Gal-6cDNA基因片段。得到了大小为250bp片段。将扩增产物纯化并克隆到PGEM-T-Easy载体上,转化感受态细胞DH-5α,经筛选获得重组质粒并测序,用P3/P4引物从重组质粒中扩增出成熟肽,大小约150个bp。测序后Blast分析表明,安徽三黄鸡序列与基因库上已发表的序列相差一个碱基,Gal-6多肽共有67个氨基酸组成,分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。     

鸡β-防御素-2(Gal-2)基因在大肠杆菌中的融合表达与纯化

本试验通过优化基因工程菌pMAL-c2X-Gal-2-TB1的表达条件,找到使融合蛋白表达量达到最大的最佳表达条件,后采用Amylose树脂预装柱对可溶性目的蛋白分离、纯化和Fac-tor Xa因子酶切,为了得到Gal-2,再次过柱纯化,每一步产物用SDS-PAGE方法检测.结果融合蛋白的分子量约为50KD,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的36%;纯化后的融合蛋白纯度达90%以上,且经再次纯化得到纯度较高的Gal-2.     

鸡β-防御素-1基因(Gal-1)在大肠杆菌中的融合表达与纯化

内源性抗菌多肽防御素是机体先天性免疫系统的重要组成部分，可帮助机体防御外界病原微生物的入侵。鸡β防御素-1（Gallinaein-1，Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用，具有很好的研究开发价值。本研究利用PCR技术从重组质粒pGEM-TEasy-gal-1中克隆出Gal-1基因成熟肽区，将该基因插入原核表达载体pET-32a（＋）中，构建重组质粒pET-32a（＋）-gal-1，然后用重组质粒转化大肠杆菌BL-21。挑选阳性克隆菌，用浓度为0．5mmol／L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳显示在目标位置约25kD处出现了条带并用Werstern Blot进行了鉴定。表明Gal-1基因在大肠杆菌以融合形式得到了表达。经灰度扫描显示重组蛋白表达量占细菌总蛋白的15．54％。用50％Ni-NTA纯化树脂进行层析纯化，在洗脱液E中出现单一条带。Gal-1多肽在pET-32a（＋）质粒表达体系中成功表达为鸡防御素多肽下一步的研究奠定基础。     

鸡β－防御素－2基因的克隆及原核表达载体的构建

鸡β－防御素是一类广谱抗茵阳离子小肽的总称,一般具有3个分子内二硫键。防御素对细菌、真菌乃至某些被膜病毒具有广谱杀伤作用。试验根据已发表的Gal－2基因序列,设计并合成了一对引物。以骨髓中的总RNA为模板,利用RT—PCR技术扩增目的片段并克隆到pGEM—TEasy载体上,经筛选鉴定获得阳性重组子pGEM—T—Gal－2。再经EcoRI、XbaI双酶切,插入pMAL—c2x质粒构建表达载体。利用PCR技术和酶切反应筛选转化子成功获得pMAL—c2x—Gal－2重组质粒。     

猪源β-防御素2和3的研究进展

防御素是一类阳离子抗菌肽,广泛存在于动物和植物体内。猪源β-防御素2和β-防御素3能抵抗猪体内病原微生物,并能调节机体免疫功能,对生殖发育也有一定的生理作用。猪源β-防御素2能促进仔猪生长,对猪红细胞毒性低,能在毕赤酵母中高效表达,其转基因猪也具有较好的抗病性能。因此,猪防御素具有潜在的应用价值。本文就猪源β-防御素2和β-防御素3在体内的表达分布和调控因素、参与调节的信号通路、在生殖发育和畜牧养殖方面的新功能及应用潜力进行综述。     

丁酸钠与VD3对IPEC-J2细胞β-防御素3 mRNA表达的协同作用

研究旨在验证丁酸钠与维生素D3 (VD3)联合使用对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)β-防御素-3(pBD3) mRNA表达的协同作用.试验分别设置丁酸钠组、VD3组、丁酸钠与VD3联合使用组.使用荧光定量PCR检测各试验组对猪小肠上皮细胞pBD3基因表达水平的影响.结果 表明,不同浓度丁酸钠均能上调β-防御素-3 m...     

鸡β-防御素-13(Gal-13)成熟肽序列的克隆及表达

本研究旨在克隆鸡成熟肽c DNA序列并构建原核和真核表达载体,研究其在大肠杆菌和毕赤酵母中诱导后融合蛋白的表达情况。利用PCR技术从pDM19-T-Gal-13质粒中扩增得到成熟肽c DNA序列,将其亚克隆到p GEX-4T-1和p PICZαA质粒中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZαA-Gal-13,转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母X-33,挑取阳性转化子用进行鉴定和诱导表达,(Tricine)SDS-PAGE检测产物的表达情况,以及真核诱导表达上清液对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。结果显示,成功克隆得到的成熟肽序列长为128bp,包含ATG片段和酶切位点与保护碱共20bp,共编码36个氨基酸;构建获得重组原核表达质粒pGEX-4T-1-Gal-13和真核表达载体pPICZα-A-Gal-13,并将重组质粒转化到大肠杆菌BL21和酵母X-33,进行诱导表达产物经电泳分析后结果显示,Gal-13融合蛋白在大肠杆菌和酵母中得到大量表达,原核表达分子量是31ku并以包涵体的形式存在,真核表达的分子量5.9 ku并分泌到发酵液中;抑菌试验表明,发现真核表达的发酵无菌上清对鸡白痢沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。     

鸭β-防御素-2基因的克隆测序与组织表达分析

利用RT-PCR技术,从肝脏组织中扩增到鸭AvBD2基因.经测序表明,扩增到的鸭AvBD2大小为350 bp,含有1个大小为195 bp的开放阅读框,编码64个氨基酸残基.组织表达分析表明,鸭AvBD2基因在鸭脾脏和肾脏中大量表达;心脏和肝脏中有少量表达;肺脏和骨髓有中等水平表达;在胸腺、腔上囊、小肠、胰腺、腺胃、食管、气管、舌头、胸肌、卵巢、皮肤中未见表达.     

β-防御素caBD-1 mRNA在骆驼组织器官中的表达

根据已知的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA序列设计了1对预计扩增产物为203bp的引物，通过RT—PCR检测骆驼的整个消化道黏膜、肝、胰腺、气管黏膜、肺、肾、膀胱黏膜、卵巢、子宫内膜、脾、淋巴结、心等器官内caBD-1 mRNA的表达。结果显示：caBD-1 mRNA在整个消化道、气管、膀胱、子宫等管状器官内的黏膜层有表达，而在实质性器官如心、肝、胰腺、肺、脾、淋巴结、卵巢、肾中无表达。提示，骆驼体内的这种内生性抗微生物肽有助于骆驼的黏膜宿主防御。     

犬β-防御素cBD103的原核表达和纯化

将犬β-防御素103(canineβ-defensin 103,cBD103)基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-cBD103,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,并用肠激酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果表明,质粒pET-cBD103经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,大肠埃希菌中成功表达出目的蛋白,蛋白大小约为24ku,以可溶性表达为主。经过纯化和酶切,得到大小8ku的cBD103,与预期大小一致。该研究在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,为下一步大规模制备cBD103奠定了基础。