香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的分子特征与时空表达模式

为弄清香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因(MaSSIII-1)的分子特征及时空表达模式，以‘巴西蕉’果肉为试材，采用PCR法进行MaSSIII-1基因克隆，通过Quantitative real-time PCR (qPCR)和Western blot技术对MaSSIII-1基因及其蛋白表达模式进行分析。结果显示：MaSSIII-1基因cDNA全长为2397 bp，编码798 个氨基酸，包括4 个典型的结构域，GenBank 登录号为KU757067。MaSSIII-1 基因在香蕉根、球茎、花和苞片中表达量较低，在叶、果皮和果肉中表达量较高；随着香蕉果实发育，MaSSIII-1 基因表达量逐渐上升，在抽蕾后50~60 天达到最大；随着果实采后成熟，MaSSIII-1 表达量在采后5 天达到最大，随后逐渐下降。在香蕉果实不同发育及采后成熟阶段，MaSSIII-1 蛋白呈现出与mRNA水平相一致的表达趋势。证明MaSSIII-1 基因的表达不仅涉及到香蕉果实支链淀粉合成代谢，可能还涉及采后早期果实成熟或者支链淀粉降解。     

香蕉ACO反义基因转化夫人指蕉的研究

本研究利用RT-PCR法,从成熟夫人指蕉(Musa spp.AA group)果实中分离得到ACO基因编码区全序列,经测序分析,该基因编码区共957 bp,编码318个氨基酸,与已报道的香蕉ACO基因的同源性为77%~99%。在此基础上,将ACO基因反向插入到植物表达载体p1321得到重组质粒p1321-a ACO。利用根癌农杆菌介导法转化夫人指香蕉胚性细胞悬浮系,经GUS组织化学染色和PCR鉴定,获得一批转反义ACO基因香蕉植株。通过转反义ACO基因香蕉果实贮运实验,结果表明外加乙烯利,转基因和对照果实成熟期无明显差异,并表现出成熟果实的正常生理特性。但是在采后常温无乙烯利处理的条件下,转基因香蕉的成熟期较对照推迟了10 d左右。研究结果表明通过反义ACO基因转化香蕉,有望获得耐贮运香蕉新种质。     

香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSⅢ-1的分子特征与时空表达模式

为弄清香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因(MaSSⅢ-1)的分子特征及时空表达模式,以‘巴西蕉’果肉为试材,采用PCR法进行MaSSⅢ-1基因克隆,通过Quantitative real-time PCR (qPCR)和Western blot技术对MaSSⅢ-1基因及其蛋白表达模式进行分析。结果显示:MaSSⅢ-1基因cDNA全长为2397 bp,编码798个氨基酸,包括4个典型的结构域,GenBank登录号为KU757067。MaSSⅢ-1基因在香蕉根、球茎、花和苞片中表达量较低,在叶、果皮和果肉中表达量较高;随着香蕉果实发育,MaSSⅢ-1基因表达量逐渐上升,在抽蕾后50～60天达到最大;随着果实采后成熟,MaSSⅢ-1表达量在采后5天达到最大,随后逐渐下降。在香蕉果实不同发育及采后成熟阶段,MaSSⅢ-1蛋白呈现出与mRNA水平相一致的表达趋势。证明MaSSⅢ-1基因的表达不仅涉及到香蕉果实支链淀粉合成代谢,可能还涉及采后早期果实成熟或者支链淀粉降解。     

粉蕉MbACS7基因的克隆及表达分析

乙烯合成及其效应是决定香蕉果实成熟的核心要素,其中1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(ACS)是乙烯合成途径的限速酶。粉蕉果实成熟速度较快,保鲜难度较大。研究粉蕉ACS家族基因的特征和表达模式可为控制香蕉果实成熟进程和延长货架期提供理论依据。本研究从粉蕉中克隆获得一个全长序列为1 458 bp的目的片段,编码485个氨基酸,分子量为54.751 kD,具有PLN02450保守结构域(37～1 377氨基酸),属于ACS基因家族蛋白,因此被命名为MbACS7。理化性质分析表明MbACS7蛋白亲水且不稳定。进化分析表明MbACS7蛋白预测的氨基酸序列与苦瓜(Momordica charantia) ACS蛋白的氨基酸序列(CAE53271.1)遗传关系较近。瞬时表达分析表明MbACS7蛋白在烟草表皮细胞的细胞核中强烈表达,表明该蛋白可能在细胞核中发挥着重要的生理功能。实时荧光定量表达分析表明MbACS7基因在粉蕉果实成熟期表达量最高,为果实发育初期的900多倍。本研究为进一步解析MbACS7基因在粉蕉果实乙烯生物合成中的功能奠定基础,也为改良香蕉果实贮藏性提供基因资源。     

番木瓜成熟衰老蛋白基因CpSSA的克隆与表达分析

衰老相关蛋白(senescence-associated protein,SSA)基因在果实成熟衰老中起重要作用。为了探究番木瓜衰老相关蛋白基因,以‘大白八号’番木瓜果实为材料,采用RACE技术扩增出番木瓜SSA基因全长cDNA序列,命名为CpSSA(登录号:KX885408)。生物信息学分析显示,CpSSA全长1 203 bp,包含一个420 bp的开放性阅读框。番木瓜SSA蛋白含有139个氨基酸,分子质量为15.172 4 kD,等电点为9.61。该蛋白的氨基酸序列与桃、葡萄、杨树、菠菜的氨基酸序列有较高的同源性。系统进化树显示,番木瓜SSA与葡萄SSA表现出最小的进化距离,亲缘关系最接近。用荧光定量PCR分析在不同处理不同成熟度番木瓜果实中CpSSA基因的表达差异,结果显示在乙烯处理后的6 h和12 h表达量显著升高,在1-MCP处理中表达量较低,在乙烯/1-MCP处理果实中的表达模式与成熟衰老有一定相关性,推测CpSSA基因可能参与了番木瓜果实的成熟衰老进程。     

森林草莓FvWRKY46基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子在调控植物生长发育方面有重要作用,但是对于其参与草莓果实品质的影响尚不明确。本研究以森林草莓‘Hawaii4’为材料,克隆转录因子Fv WRKY46并进行生物信息学分析,利用烟草叶片瞬时转化法对FvWRKY46进行亚细胞定位,用RT-qPCR分析FvWRKY46在草莓不同时期和不同组织中的相对表达量。结果表明：FvWRKY46基因全长1 107 bp,共编码368个氨基酸,从森林草莓‘Hawaii4’中克隆到FvWRKY46基因,进行亚细胞定位得知FvWRKY46分布在细胞核中。RT-qPCR分析结果显示FvWRKY46在植物体内各个器官组织均有表达,但在果实中表达量最高,且表达量随着时间的延长在果实成熟期达到最大值。本研究表明,FvWRKY46基因可能参与调控草莓果实成熟的过程。     

香蕉ARF3基因全长克隆及其对枯萎病菌的响应特性分析

ARF3基因属于ARF基因家族的成员,主要功能是参与细胞信号转导、跨膜运输及囊泡转运。本研究根据已获得的基因片段设计4条特异性引物,采用RACE技术克隆获得了香蕉ARF3基因cDNA全长序列,命名为MuARF3。该基因序列全长共1427 bp,开放阅读框长度为1166 bp,共编码338个氨基酸。BLAST结果显示,香蕉ARF3基因全长核苷酸序列与已报道的其它植物ARF3具有69%～74%的相似性,氨基酸序列有81%～93%的相似性。用香蕉枯萎病菌4号生理小种侵染香蕉根系后,分析得出的结果表明,侵染根系后香蕉ARF3基因的表达量在侵染后12h达到最高,并且随着时间推移逐渐降低。由此说明本研究获得的MuARF3基因对香蕉枯萎病菌4号生理小种侵染具有应急响应,为进一步利用该基因提供参考。     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。     

粉蕉ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

本研究根据GeneBank公布的ACC氧化酶(ACO)基因的保守序列设计一对引物,通过RT-PCR方法从成熟粉蕉果实(ABBgroup)中克隆到一条新的香蕉ACO基因全序列。该氧化酶cDNA全长1172bp,基因编码区共957bp,推测其编码318个氨基酸。分析发现,该基因除了与登录号为X95599的香蕉ACO基因核苷酸序列一致性为84%外,与其它基因库上公布的香蕉ACO基因核苷酸序列一致性为94%￣98%,而且,这些香蕉ACO基因核苷酸推导出的氨基酸序列总体一致性为95.81%。聚类分析结果表明,相同基因型的果实克隆出的香蕉ACO氨基酸具有更多的同源性。另外,将该香蕉ACO氨基酸与其它12种重要的果实的ACO氨基酸相比较,其序列一致性也很高。其与芒果一致性高达98%,与菠萝、番木瓜、葡萄、苹果,桃、梨、柑、橙等一致性也在68%￣76%之间。同时发现这13种ACO氨基酸有9个较长的保守结构域。系统树分析结果表明,具有相似的生长环境和相似的生理特性的果实ACO基因具有更多的同源性。     

苦瓜转录因子McEIL2的克隆及其表达分析

本研究从已构建的苦瓜果实均一化文库筛选得到一个EIN3-like同源EST序列,结合RACE技术,克隆得到EIN3基因c DNA全长序列,命名为Mc EIL2(Gen Bank登录号:KF595122)。该基因全长2 122 bp,开放阅读框1 890 bp,编码629个氨基酸,预测该蛋白的分子量为71.58 k D,与黄瓜Cus EIN3、甜瓜Cm EIL1、苜蓿Mt EIL1、绿豆Vr EIL1和番茄Le EIL1的蛋白同源性分别为89.61%、78.37%、71.23%、69.09%和65.66%。Mc EIL2基因的编码蛋白亚细胞定位于细胞核,荧光定量分析表明Mc EIL2基因表达量在幼果期先强后弱,绿熟期最低,破色期表达量大幅增加至最高随后下降,推测该基因参与苦瓜果实成熟软化调控过程。本研究初步明确了Mc EIL2基因在苦瓜成熟过程表达模式,可为今后进一步揭示苦瓜果实成熟软化的分子机制奠定基础。     

香蕉乙醇脱氢酶基因的克隆及其逆境胁迫表达

香蕉乙醇脱氢酶基因的克隆及在逆境胁迫下的表达分析,将为进一步研究ADH在香蕉中的功能奠定基础。本研究从香蕉果实抑制差减文库中获得一条香蕉乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE技术获得其全长,命名为MaADH。MaADH的cDNA全长1140 bp,编码379个氨基酸。生物信息学分析该基因编码的蛋白分子量为40.7 kDa,等电点为7.09。保守结构域分析发现,该基因具有MDR保守结构域,包含22个NAD结合位点、11个底物结合位点和4个锌结合位点。系统进化树分析表明,MaADH与拟南芥和甘蓝亲缘关系较近。MaADH在盐胁迫和低温胁迫处理的香蕉苗中上调表达;在干旱胁迫下该基因是先上调表达,随后下调表达;在伤害胁迫下是先下调表达后上调表达,但变化不明显。研究说明,香蕉中的乙醇脱氢酶基因在香蕉适应盐、低温、干旱和伤害等逆境中发挥重要的作用。     

津田芜菁BrSIZ1基因克隆、定位及表达

SIZ1是植物细胞蛋白质翻译后修饰SUMO化的E3连接酶,参与植物蛋白相互作用、定位和抗逆反应等。为研究BrSIZ1在津田芜菁中的表达特性,本研究克隆了津田芜菁SIZ1基因全长cDNA序列,命名为BrSIZ1 (GenBank登录号为KY441465),该基因全长2754 bp,其ORF全长2571 bp,编码856个氨基酸残基的多肽。构建了BrSIZ1-GFP表达载体进行亚细胞定位研究,结果显示BrSIZ1-GFP定位于细胞核内,可能在细胞核中发挥其功能。利用荧光定量PCR检测表明,该基因表达量在叶子中最高,幼苗和红色根皮中次之,表达具有组织特异性。而且BrSIZ1在芜菁根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导,在4°C、37°C胁迫的幼苗中,表达量增加。     

甜瓜乙烯受体基因Cm-ETR2的克隆及其在果实发育成熟过程中表达特性的分析

为研究Cm-ETR2基因在甜瓜果实发育成熟过程中的作用机理,根据已报道的甜瓜(Cucumis melo)品种Cantalupensis的Cm-ETR2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cvHetao)成熟果实中克隆得到了乙烯受体基因Cm-ETR2 cDNA,序列分析显示,序列长度为2 304 bp,编码767个氨基酸。利用实时荧光定量RT-PCR方法,对其在河套蜜瓜果实发育成熟过程中的表达特性进行了分析,Cm-ETR2基因在15DAP至30DAP表达基本没有变化,35DAP表达量开始上升,上升趋势一直持续至45DAP,且45DAP表达量为15DAP的9倍。     

枣ZjERF53转录因子的转录激活分析及互作蛋白筛选

乙烯应答因子广泛参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应过程。本研究克隆了1个在枣(Ziziphus jujuba Mill.)果实成熟后期高表达的ZjERF53转录因子,对其进行了亚细胞定位、转录激活活性和互作蛋白筛选研究,以揭示其生物学功能。研究结果表明：ZjERF53基因编码区序列全长为1 155 bp,能在细胞核和细胞膜中表达;ZjERF53具有自激活活性,其转录激活功能区域位于蛋白序列C端;以无自激活活性pGBKT7-ZjERF53-N为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选枣果实cDNA文库,共获得4个互作蛋白。本研究揭示了ZjERF53可能参与枣树抗病和抗旱等非生物胁迫响应,为解析ERF参与调控枣树生物学过程的分子机制提供了工作基础。     

桑树EIN2基因的分离与表达

EIN2是植物体内乙烯信号转导的中心元件,负责将乙烯信号由内质网传递到细胞核中。本文通过检索桑树基因组数据,获得一个EIN2候选基因(MaEIN2),并进行生物信息学分析和表达分析。该MaEIN2全长5614 bp,由7个外显子和6个内含子组成,包含3921 bp的CDS,编码1036个氨基酸残基。MaEIN2在进化树中与草莓、桃树等双子叶植物的EIN2蛋白关系较近,与单子叶植物关系较远。MaEIN2在老叶和成熟果实中的表达量分别高于在幼叶和幼果中,且随果实发育呈逐渐上升趋势,MaEIN2可能与器官的成熟衰老有关。选用乙烯利、ABA和NaCl处理桑树种苗,乙烯利能够促进MaEIN2的表达,而ABA和NaCl抑制MaEIN2的表达。本文为深入研究MaEIN2基因的功能奠定了基础。     

桃果实ACC氧化酶基因的克隆及序列分析

乙烯是调控果实成熟衰老的内源激素,有效地调控乙烯的生物合成便是控制果实成熟的关键,而ACC氧化酶是植物乙烯生物合成途径中的限速酶之一。本研究以成熟的白粉桃为材料提取果实总RNA,克隆ACC氧化酶基因,旨在利用反义技术抑制乙烯合成,延迟桃果实成熟,提高硬度。将克隆片段与pMD18-T载体连接并转化到E.coliDH5α,经PCR、酶切和测序鉴定。分析表明该基因全长为1246bp,其中编码区长960bp,共编码319个氨基酸,与已登陆的ACC氧化酶基因(AF319166)核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为99%和98%,表明成功的克隆了ACC氧化酶基因。经生物信息学分析,推测该蛋白的分子式为C1626H2542N420O485S12,相对分子质量为36.12kDa,等电点为5.27;该蛋白为亲水性非分泌型蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主,是一个紧凑型球状结构域。     

津田芜菁泛素结合酶BrUBC11基因的克隆及表达分析

为阐释津田芜菁Br UBC11基因的表达特性,克隆了津田芜菁UBC11基因的全长c DNA序列,命名为Br UBC11,Gen Bank登录号为KM396887。其c DNA全长685 bp,ORF区全长447 bp,编码148个氨基酸的开放阅读框;亚细胞定位结果显示,Br UBC11-GFP定位于细胞核内,表明Br UBC11蛋白可能在细胞核中发挥其功能。荧光定量PCR检测Br UBC11在芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在花瓣中表达量最高,花蕾中次之,具有组织特异性。而且Br UBC11在芜菁白色根皮中的表达受长波紫外线(UV-A)诱导。研究结果显示,在芜菁中,UBC11属于多功能基因,具有潜在的参与花发育和UV-A信号转导相关途径的功能。     

橄榄果实氨基酸转运蛋白基因CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4的克隆与表达分析

氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)参与植物氨基酸的转运、吸收、氮代谢等途径。为了解橄榄果实AAP基因在不同品种果实成熟发育过程的表达模式,本研究以呈味差异显著的两个品种普通橄榄‘长营’和清橄榄‘梅埔2号’为试验材料,通过RT-PCR方法克隆了3个APP基因的cDNA序列全长,并对其进行了生物学信息分析与亚细胞定位分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析了两个不同品种果实在不同发育时期的CaAAPs表达情况。结果表明：3个基因的序列长度分别为1 254 bp (CaAAP1)、405 bp (CaAAP2)、633 bp (CaAAP4),其编码的蛋白均为不稳定疏水性蛋白,分别含有7、1、5个跨膜区,保守基序差异较大;亚细胞定位结果表明,CaAAP1、CaAAP2主要在细胞质膜上表达。荧光定量结果表明随着果实的发育,CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4在‘长营’果实的表达量均呈显著上升趋势,在‘梅埔2号’的表达量变化趋势较平缓,且在170 d时显著下降,两个品种CaAAPs家族基因表达量差异大,表明CaAAP1、CaAAP2、CaAAP4基因可能对橄榄果...     

香蕉MabZIP53基因的克隆和表达分析

bZIP转录因子在植物的生长发育和响应胁迫的过程中起重要作用。本研究利用全长均一化cDNA文库获得一条全长438 bp cDNA序列,与香蕉基因组数据库比对之后,将其命名为MabZIP53,编码145个氨基酸,预测分子量为35.24 kD,等电点为5.22,其编码的蛋白定位于细胞核。系统发育分析表明MabZIP53与凤梨(XP_020114228.1)、大叶藻(KMZ62676.1)的亲缘关系较近。MabZIP53在不同非生物胁迫(低温,干旱,盐)下均上调表达,尤其干旱胁迫下相对表达量最为显著。在接种Foc TR4后,抗病品种‘GCTCV-119’中MabZIP53表达量显著上调,而感病品种巴西蕉中MabZIP53表达量下调表达。这些研究结果表明MabZIP53可能参与香蕉响应生物胁迫和非生物胁迫的过程,为香蕉的遗传改良提供理论基础。     

苎麻肉桂酰辅酶A还原酶基因cDNA序列的克隆与分析

根据苎麻转录组测序信息,利用RACE法克隆出2个肉桂酰辅酶A还原酶基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并利用荧光定量技术对苎麻快速生长期、成熟期和成熟后期该基因在木质部和韧皮部的表达模式进行研究。结果表明,BnCCR1全长1056 bp,编码277个氨基酸,Blast比对BnCCR1基因与白桦、蓖麻CCR基因核苷酸序列相似性均为70%,推测的氨基酸与蓖麻CCR基因氨基酸序列相似度为77%,蛋白质预测显示其N端存在一个3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-10的保守域;BnCCR2基因全长1291 bp,编码248个氨基酸,Blast比对BnCCR2基因与毛果杨CCR基因核苷酸序列相似度为74%,推测的氨基酸与蓖麻、毛果杨CCR基因氨基酸序列相似度均为81%,蛋白质预测显示其N端存在一个3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-4的保守域;BnCCR1和BnCCR2基因编码蛋白三维模型与矮牵牛CCR基因相似度分别达30.68%、44.77%,建模结果可靠;荧光定量结果显示BnCCR1和BnCCR2基因具有时期表达差异性,不具有组织表达差异,但不同组织表达量具有差异。推测BnCCR1和BnCCR2基因是存在于苎麻木质素代谢中的两种CCR基因。