实时荧光定量PCR检测高温即时浸酸对蚕卵中家蚕微孢子虫的灭活效果

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)引起的家蚕微粒子病是对蚕种生产危害最为严重的家蚕病害,蚕种浸酸处理是蚕业生产中常用的一种防病处理手段。为探明浸酸处理对家蚕微粒子病的防治效果,将家蚕二化性四元杂交组合两广二号的带毒蚕卵分别进行常规即时浸酸处理和高温即时浸酸处理,采用实时荧光定量PCR对卵龄24~240 h蚕卵中的家蚕微孢子虫进行定量检测。结果发现,常规和高温浸酸处理后每日取样蚕卵中家蚕微孢子虫的检测值较阳性对照组均显著降低,高温浸酸组又明显低于常规浸酸组,表明2种浸酸处理对蚕卵中的家蚕微孢子虫均有灭活作用,且高温处理的灭活效果更为显著。对蚕卵孵化后饲养至3龄眠和5龄起的幼虫逐条进行显微镜镜检,结果显示高温即时浸酸处理对家蚕微粒子病的相对防治效果分别为92.30%±2.95%和81.80%±0.06%。综上表明,高温即时浸酸处理带毒蚕卵对家蚕微粒子病有显著的防治作用。     

蚕卵高温即时浸酸阻断家蚕微粒子病胚种垂直传播的效果

由家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染引发的家蚕微粒子病可以通过胚种垂直传播,如能在蚕种人工孵化处理过程中杀灭家蚕微孢子虫,阻断其胚种传播,将有效控制病害对养蚕业尤其是蚕种制造业造成的危害。对家蚕二化性四元杂交组合两广二号的带毒卵进行高温即时浸酸处理,考察浸酸温度和浸酸时间对蚕卵中Nb的灭活作用及实用孵化率的影响。结果表明:产卵后20 h的带毒蚕卵用47.5℃或48℃质量浓度为1.075 g/m L的盐酸溶液分别浸渍6.0、6.5和7.0 min,对蚕卵实用孵化率无明显影响;依据蚕卵孵化后饲养至3龄眠蚕用显微镜镜检Nb的数据,测算高温即时浸酸处理对家蚕微粒子病的相对防治效果可达90%~97%。此外,采用Real-time PCR扩增方法,检测高温即时浸酸处理组蚕卵孵化蚁蚕样本中的Nb孢子目标基因的相对拷贝数,较常规浸酸处理组蚕卵孵化蚁蚕样本下降了97%~99%。上述结果表明高温即时浸酸处理对蚕卵中的Nb孢子有显著的杀灭作用,能有效阻断家蚕微粒子病的胚种垂直传播,可作为防治家蚕微粒子病的一种重要措施。     

一种家蚕微孢子虫感染成品卵检测方法的研究

感染家蚕微孢子虫的成品卵检测是业内关注的技术问题之一。用磨碎管分装1 000粒蚕卵并加海绵塞，进行一段式催青的实验室二日孵化率达98.25%或以上，对生产用不同蚕品种、越年或冷藏浸酸蚕种及不同单位生产蚕种的二日孵化率最低为94.40%。用含0.01%十二烷基磺酸钠和2.00%氢氧化钠的溶液浸泡和磨碎蚕卵样本(约1 000粒),固形物去除率为83.38%。5龄起蚕添食感染5×10⁵颗/mL家蚕微孢子虫孢子悬浮液后获取的混合蚕卵，在催青孵化后第7天检出率明显上升。1 000粒蚕卵混入3 000颗家蚕微孢子虫孢子的检出率为100%。蚕卵磨碎液用PBS缓冲液(pH=7.2～7.6)稀释40倍或以上时，qPCR法检测可稳定检出家蚕微孢子虫，检测灵敏度为4×10⁶颗/mL,低于光学显微镜法的1.5×10³颗/mL。105个一代杂交蚕种母蛾检疫批(166 623张毛种)母蛾检测和蚕卵集团检测的检出情况类似。不论是母蛾检测还是成品卵检测都涉及家蚕微孢子虫的胚传率和流行病学风险管控的阈值确定，上述研究提供了一种成品卵集团检测的方法，但实际...     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

35℃高温对家蚕微孢子虫在BmN细胞中发育、增殖的抑制

研究了 35℃高温处理对家蚕微孢子虫体外发育、增殖的影响时期和时间。结果表明 :35℃高温对家蚕微孢子虫体外发育、增殖具有明显的抑制作用 ,其最为敏感的时期是微孢子虫的裂殖体增殖阶段 (接种后 2 4～ 72h) ,进入孢子形成期 (接种 72h以后 )抑制作用则明显降低。     

家蚕微孢子虫感染家蚕对其中肠和血液蛋白酶活性影响

本试验测定了不同浓度剂量微孢子虫感染家蚕后,家蚕中肠和血液中蛋白酶的变化.并对不同浓度剂量家蚕微孢子虫感染家蚕后对家蚕发育的影响和不同组织中所含微孢子虫孢子的浓度等作了初步的研究.从本实验中可以看出,感染不同浓度微孢子虫的家蚕,体内相同组织的微孢子虫数量存在显著差异.而感染相同浓度微孢子虫的蚕,不同组织中微孢子虫的数量也有差异,中肠的微孢子虫数量远高于其他部位.感染微孢子虫后,家蚕血液中的蛋白酶活性显著升高,中肠的蛋白酶的活性变化不显著,而感染微孢子虫的数量对血液和中肠中的蛋白酶的活性无显著影响.     

家蚕着色卵即时浸酸试验

研究了家蚕产卵后在25℃保护温度下经40h、60h已着色蚕卵即浸6min、9min、12min、15min、18min对孵化率的影响,结果表明:产后40h的蚕卵即浸9 min为最佳浸渍时间,孵化率达95%以上,产后60h的蚕卵即浸18min为最佳浸渍时间,孵化率达92%以上。     

几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制

通过5种对家蚕微孢子虫发育有抑制作用的化学药剂--脓微灵、防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛不同处理时期、时间在体外对家蚕微孢子虫发育、增殖影响的研究表明：供试的5种化学药剂对家蚕微孢子虫体外发育、增殖均产生不同程度的抑制作用。脓微灵的显抑制作用的时期表现在从接种0h开始的处理区，孢子形成数仅为对照的11.89%～15.68%，主要体现为对微孢子虫、芽体的杀灭作用或对微孢子发芽的抑制作用。防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛对家蚕微孢子虫体外发生、增殖抑制作用最显的时期，均表现在接种24h～72h，从裂殖体分裂、增殖到孢子形成期之前这一对外界环境条件的变化最为敏感的发育阶段，尤以48h～72h最有效，其孢子形成数为对照的22%～38%。而抑制作用与化学药剂作用时间长短的相关性则不十分明显。     

母蛾经高温干燥处理不同时间对体内家蚕微孢子虫的灭活效果

母蛾抽样检查是家蚕微粒子病检疫工作的重要组成部分。为了明确母蛾检疫前高温干燥灭活可能存在的家蚕微孢子虫的有效处理时间,以被家蚕微孢子虫感染的母蛾为材料,在高温(71℃)条件下分别处理1、2、3、4、5和6 h后,分离母蛾体内的家蚕微孢子虫进行添毒试验,检查其灭活情况。结果表明,高温处理3 h以上的母蛾体内分离的家蚕微孢子虫给3龄、4龄健康起蚕添食后,蚕体未出现感染症状,证明添食的微孢子虫已经失去致病活性。据此建议在蚕种生产的母蛾检疫过程中,须在71℃高温条件下对母蛾处理3 h以上,以避免因抽样母蛾体内的微孢子虫扩散造成的二次环境污染。     

干热空气处理防治家蚕微粒子病胚种传染的研究

采用干热空气对广东现行10个家蚕品种进行热处理,结果表明,蚕卵产后常温（25～27℃）保护12h,46℃热处理60min或47℃热处理40min,不影响实用孵化率,而对微粒子病胚种传染的防治效果达到93％～100％;蚕卵的溶菌酶和超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化物酶（POD）,过氧化氢酶（CAT）等三种保护酶系统活力均升高;电子显微镜观察到治愈病卵正常发育至蚁蚕,未经热处理的病卵产下132h后形成孢子,孵化出带病蚁蚕。     

盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化及其与滞育性的关系

从家蚕C108品种蚕卵精制酯酶A4,首次测定了产卵后24～96h浸酸蚕卵酯酶A4的ATPase活性。蚕卵经盐酸处理后在体外5℃1～2d或体外25℃1～3h出现酶活性峰。与低温活化蚕卵比较,产卵后24～96h的浸酸蚕卵,在体外5℃酶活性峰出现时间提早了8．5～22d,在体外25℃提早了3～9h。浸酸后蚕卵迅速解除滞育,滞育发育时间显著缩短。将不同卵龄未浸酸蚕卵与盐酸处理蚕卵酯酶A4的ATPase活性峰出现时间差制成曲线,在体外5℃或25℃的结果几乎都完全与5℃冷藏时蚕卵的滞育发育时间曲线重叠。盐酸处理蚕卵酯酶A4的活性变化与蚕卵活化有高度相关性。     

双控干热空气处理设备研制及应用于预防家蚕微粒子病胚种传染的效果

干热空气处理是一种物理消毒方法,通过相对湿度在50%以下的高温环境破坏病原微生物的蛋白质与核酸结构而达到灭菌效果。以操作简便、性能稳定、安全可靠为目标,研制出一种专门用于蚕种消毒预防家蚕微粒子病胚种传染的双控干热空气处理设备。该设备采用导热系数、阻燃等级高的双面不锈钢板聚氨酯保温夹心材料,应用双加热控温技术为蚕种容纳室内提供精确稳定的目的温度,以确保干热空气处理的消毒效果和蚕种安全,设备单次处理蚕种的最大容量为600大张种(1大张蚕种相当于4张市售蚕种)。将家蚕一代杂交种置于该设备中以46℃干热空气处理60 min,对微孢子虫进行灭活消毒,当供试蚕种含家蚕微孢子虫的病卵率为22.35%~69.83%时,其防治效果达到93.98%~98.79%,而对病蛾率约30%的超毒批蚕种的防治效果达到97%~99%;在该设备中进行干热空气处理后的蚕种,其孵化率及幼虫饲养的产茧量等主要经济性状与未处理组相比无显著差异。试验结果表明,研制的双控干热空气处理设备可应用于蚕种生产预防家蚕微粒子病胚种传染,干热空气对家蚕微孢子虫的杀灭效果显著,且对蚕种的生产性能无显著不良影响。     

高频电流处理蚕卵对蚕生长发育的影响

关于磁场对生物体的作用国内外均有深入的研究,但用高频电流处理家蚕卵的研究目前尚未见报道.本试验采用10kV高频脉冲增压电流仪,对反转期(己1)的家蚕卵进行不同时间的处理,然后对蚕卵孵化率、蚕体生长发育、茧质和蛹体重进行了调查分析,以探讨电磁场对家蚕生长发育各阶段产生的生物效应.     

多重引物PCR特异性扩增微孢子虫DNA片段

利用几种引物的混合物,检验多重引物PCR早期检测不同种类家蚕传染性微孢子虫的适用性。结果是:当用目的微孢子虫的基因组DNA作为DNA模板时,用本研究设计的多重引物进行PCR可以扩增出特异性DNA片段。而当采用家蚕或其他微生物的基因组DNA作为DNA模板时,没有获得PCR产物。另外,只有当家蚕被各种微孢子虫感染时,多重引物PCR才能扩增出特异性ONA片段。当从受到家蚕微孢子虫感染的蚕卵中抽提基因组DNA作为DNA模板时,采用多重引物PCR也可以扩增出特异性DNA片段。从受家蚕微孢子虫感染的家蚕中抽提基因组DNA作为DNA模板时,也可以得到类似的结果。这些发现说明本研究设计的多重引物PCR适合用于蚕种微粒子孢子感染性检验。     

带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法研究

为促进用PCR法检测家蚕微粒子病的生产应用,对带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法进行了研究。结果表明,蚕卵经30%KOH、27℃预处理后抽提的核酸能满足PCR检测对DNA质量的要求。以该方法抽提的DNA为模板,进行蚕卵集团检测,结果10~100粒蚕卵中混有1粒“有毒”卵,即能用PCR的方法检测出。“1/100”“有毒”卵的检出概率约为80%。     

不同来源的昆虫微孢子虫对家蚕的感染力与体外发芽率调查

从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶、桑尺蠖、斜纹夜蛾的体内收集到5种微孢子虫,以家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)为对照,检测不同来源昆虫微孢子虫对家蚕的感染力,并调查各种微孢子虫在体外用家蚕肠液与KOH混合液(pH10.5)处理后的发芽率。从菜粉蝶分离的微孢子虫(PrL M)、从不同来源桑尺蠖分离的2种微孢子虫(PaB MⅠ和PaB MⅡ)、从不同来源斜纹夜蛾分离的2种微孢子虫(Sl MⅠ和Sl MⅡ)以及家蚕微孢子虫对家蚕(蚁蚕)的半数感染浓度(IC50)分别为2.15×105、2.90×105、5.62×106、3.38×107、9.05×106和1.86×105mL-1;PrL M、PaB MⅠ、PaB MⅡ、Sl MⅠ、Sl MⅡ和Nb的体外发芽率分别为76.75%、76.00%、12.50%、2.25%、2.75%和59.25%。PrL M和PaB MⅠ对家蚕的半数感染浓度与Nb接近,对家蚕的致病性较强,2种微孢子虫经家蚕肠液与KOH混合液处理后的体外发芽率也较高;PaB MⅡ、Sl MⅠ和Sl MⅡ对家蚕的半数感染浓度依次是Nb的30倍、182倍、49倍,说明这3种昆虫微孢子虫对家蚕的感染力较弱,并且3种微孢子虫的体外发芽率也很低。     

家蚕品种“湘晖”转青卵的冷藏抑制试验及数据统计分析

家蚕转青卵冷藏抑制胚胎发育在生产上具有实用价值。为了探讨转青卵适宜的冷藏抑制处理时间,以家蚕品种“湘晖”为材料开展试验。试验于2022年、2023年分2个批次完成,设置5个不同冷藏抑制天数的试验组及对照组(不抑制),蚕卵孵化后调查一日孵化率,并对一日孵化率进行平方根反正弦转换得到的新转换值做方差分析。结果表明,对照组蚕卵的一日孵化率最高,而5个冷藏抑制组随着冷藏抑制时间的增加,一日孵化率呈逐渐下降趋势;2个批次的一日孵化率转换值均值有极显著差异(α=0.05,P<0.01);进一步做两两比较,2022年(第1批次)的一日孵化率转换值对照组与4个抑制组(冷藏抑制2～8 d)间无显著差异(P>0.05),而2023年(第2批次)的对照组与5个抑制组间的差异极显著(P<0.01),具有统计学意义。以上结果提示,“湘晖”2个批次试验蚕卵不同冷藏抑制时间处理组的一日孵化率均值不全对应相同,推测可能还存在其他因素与冷藏抑制因素一起共同影响了“湘晖”转青卵的一日孵化率。从生产效益考虑,建议家蚕品种“湘晖”非必要则不将转青卵做冷藏抑制处理,如若一定要进行转青卵的冷藏抑制,处理时间应控...     

家蚕微孢子虫在干燥的自然环境中存放不同时间对家蚕的感染性试验

通过对家蚕添食新鲜的和存放不同时间的家蚕微孢子虫,判断其微孢子虫的活力变化情况。利用不同株系新鲜的和分别存放在室内干燥自然环境中1年、2年的家蚕母蛾体内微孢子虫对4龄家蚕进行添食试验。添食新鲜的云南株和镇江株家蚕微孢子虫对家蚕都具有很强的感染性,云南株食下感染率达99.0%,镇江株食下感染率达96.5%;添食在干燥的自然环境中存放1年后的母蛾体内家蚕微孢子虫,家蚕的食下感染率云南株为5.5%,镇江株为0;添食在干燥的自然环境中存放2年后母蛾体内家蚕微孢子虫,云南株和镇江株食下感染率均为0。结果表明,在干燥的自然环境中的家蚕微孢子虫随着时间的推移会逐渐失去活性。     

蚕种用双控干热空气设备处理后的即时浸酸和冷藏浸酸条件及孵化调查

双控干热空气处理设备可应用于家蚕一代杂交种生产控制家蚕微粒子病胚种传染。为了解使用该设备是否会影响蚕种质量,对经干热空气处理后的蚕种进行常规与非常规浸酸(不同浸酸时间)以及在不同条件下保护,调查蚕种的孵化率和蚁蚕生命力,据此确定适合的浸酸与保护条件。结果表明:经过干热空气处理的蚕种即时浸酸适期为卵产下在25℃环境中保护24 h后,最适浸渍时间正交种为8.0 min、反交种为9.5 min,浸酸后的蚕种直接催青,或22℃调节3~4 h再转15℃调节13h、37 h、2.5 d后催青,或22℃调节16 h再转15℃调节1 d、2 d后催青,其实用孵化率均可达到93%以上;经干热空气处理的蚕种短期冷藏(保护至卵色呈赤豆色)和长期冷藏(保护至卵色呈固有色)后按常规浸酸,其实用孵化率也可达到93%以上,并且孵化蚁蚕的体质亦无不良影响。经双控干热空气设备处理的蚕种,蚕卵胚胎发育比正常条件下的蚕卵胚胎发育慢,故即时浸酸适期也要相应推迟;经干热空气处理后的蚕种依然耐冷藏,对孵化亦无不良影响。     

蚕熏安对家蚕微孢子虫的杀灭效果

蚕熏安熏烟消毒剂能有效杀灭家蚕微孢子虫 ,用 0 .5g/m3剂量熏烟 1 h,可以彻底杀灭桑叶叶面的家蚕微孢子虫 ,且对桑叶叶质无不良影响