利用Cre/lox重组系统获得烟草TA29-Barnase基因工程雄性不育恢复系

结合F1杂种的生产原理,利用Cre/lox重组系统,建立了一种完全有别于Barnase/Barstar恢复途径的基因工程雄性不育恢复系.将TA29-Barnase雄性不育基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与Bar基因融合后获得植物表达载体pBinBarloxTABn,通过农杆菌介导的叶盘转化法将其转入Wisconsin 38烟草获得了雄性不育转基因烟草植株.雄性不育转基因植株表现花药瘦小,不饱满,花粉量明显偏少,花粉畸形、皱缩、塌陷、极少萌发,自交无法正常座果结子.TA29-Barnase雄性不育转基因植株用来自pBinCre转基因植株的花粉授粉后则能正常结果结子.分别从pBinCre转基因植株C1与转基因雄性不育植株BN1、BN6杂交后代中筛选到23株、22株Kan和PPT双抗性植株,分子检测结果显示两个杂交组合后代中凡同时含Cre基因和Bar基因的F1植株,其TA29-Barnase雄性不育基因均被删除,删除效率达到100%.F1植株中的TA29-Barnase基因被删除后,育性被恢复,能正常开花结果.     

草莓乙烯受体FaEtr1和FaErs1基因的克隆及其反义表达载体的构建

在已报道的FaEtr1和FaErs1基因序列的基础上,设计特异引物,分别克隆草莓(Fragaria ananassa)乙烯受体FaEtr1基因580bp部分特异序列和FaErs1基因445bp部分特异序列,将上述2个片段分别反向插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建了反义表达载体pBI121Etr1和pBI121Ers1。将带有完整启动子和终止子的FaEtr1和FaErs1基因引入pCAMBIA1301中,最终获得FaEtr1和FaErs1的双价植物表达载体pFRS。将这3个重组表达质粒pBI121Etr1、pBI121Ers1和pFRS导入根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)EHA105中,PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

含绿色荧光蛋白基因与强毒部分糖蛋白B基因的马立克病毒CVI988株转移载体的构建

提取马立克病毒病毒疫苗毒株CVI988／Rispens感染的鸡（Gallus domesticus)胚成纤维细胞（CEF）的总DNA为模板，利用PCR技术扩增出病毒生长非必要的US2基因（约2.0kb)，将其克隆入T－easy载体获得载体pGUS2。用Eco R I和Bam H I消化pUR-MDVEgB质粒，回收1.8kb包含糖蛋白B（gB)基因主要抗原位点片段，插入pEGFP-C1质粒多克隆位点，构建了在CMV启动子和增强子控制下的含GFP及部分gB基因的表达盒。将此表达盒克隆入pGUS2载体US2基因中，成功地构建了含GFP及部分gB基因的转移质粒载体pEGFPgB。为其与CVI988毒株共转染CEF可获得表达GFP及强毒部分gB蛋白重组CVI988疫苗毒株打下基础。     

PchsA驱动的烟草orf25基因表达载体构建及遗传转化

为研究orf25基因的功能及其与烟草雄性不育性的相关性,通过PCR方法从质粒p UC57-Pchs A中扩增了花特异性启动子Pchs A,并以其取代植物表达载体p BI121中的组成型启动子Ca MV35S,然后将orf25基因插入到Pchs A启动子下游,构建由Pchs A启动子驱动的orf25基因表达载体,测序结果显示植物表达载体p BI121-Pchs A-orf25构建成功。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,采用根癌农杆菌介导法遗传转化雄性不育烟草MS革新3号,共获得76株转基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株为18株,转化率为23.7%。研究结果证明目的基因orf25已整合到烟草基因组中,为进一步探究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系奠定了基础。     

花药特异嵌合启动子的构建及雄性不育转基因拟南芥的获得

为了克服TA29／Barnase转基因雄性不育植物的温度敏感性，在TA29启动子上游串联了CaMV35 S启动子，同时在CaMV35 S启动子上游串联一个调节序列antherbox，构建成嵌合启动子antherbox-CaMV35 S-pTA29。该启动元件调控的GUS基因瞬间表达实验表明它是花药颈毡层特异的启动子。这个启动元件及其调控下的barnase基因构建植物表达载体转化，拟南芥菜，获得了雄性不育的转基因植株。     

毛白杨叶绿体基因启动子和终止子的克隆及其功能鉴定

摘 要：从毛白杨(Populus tomentosa)无性系植株组培苗中提取基因组总DNA，通过合成3对特异性引物，用PCR的方法扩增了包含psbA基因启动子、终止子和16S rRNA基因启动子的叶绿体DNA序列。用BLAST及DNAMAN对克隆序列进行了分析，并结合前人的研究工作，确定了两个启动子Prrn、PpsbA的-35区、-10区以及翻译调控序列等重要调控序列元件和终止子的“TAA”序列。并在序列分析的基础上合成新的引物，准确克隆了毛白杨的叶绿体16S rRNA基因启动子Prrn、psbA基因启动子PpsbA及其终止子TpsbA。利用叶绿体基因启动子的原核表达特性，分别用启动子Prrn（其后添加rbcL基因的RBS序列）和PpsbA及终止子TpsbA分别构建了GFP基因的原核表达载体pSGmT、pPGmT，并以T7启动子为对照构建了GFP基因的原核表达载体pETGm，进行了初步的原核表达实验，检测结果表明：克隆到的叶绿体基因启动子和终止子是有生物学功能的，在大肠杆菌BL21中呈组成型表达，同时还证明了RBS序列在基因表达中的重要性。     

通用型植物表达载体pCamE的构建及功能验证

为了探索通用型植物表达载体的快捷构建,本研究通过PCR克隆、酶切连接和PCR扩增获得CaMV 35S启动子序列及pUC19多克隆位点部分限制性内切酶位点和NOS终止子,构建成完整的表达组件,并将该组件插入pCAMBIA1300的多克隆位点,构建成通用型植物表达载体pCamE(GenBank登录号:JX841315)。pCamE表达组件的启动子上游、多克隆位点和终止子下游分别含有4、8和3个单拷贝限制性内切酶位点,利于外源基因的克隆和插入以及对载体启动子或终止子的修饰和更换。以绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,eGFP)为报告基因,分别构建了表达载体pCam::GFP、pCam::SalGFP和pCam::DAHPS-GFP,转化洋葱(Allium cepa L.)表皮细胞和拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),绿色荧光蛋白(GFP)和融合蛋白DAHPS-GFP在洋葱表皮细胞中均成功稳定表达;在pCam::GFP转基因拟南芥株系的根、根尖、根毛、茎表皮毛、幼叶基部、叶柄微管组织和未成熟花药等组织均能观察到强烈的绿色荧光。表明,植物表达载体pCamE是可将不同目的基因与植物染色体整合并稳定遗传的通用型植物表达载体,不受外源片段大小及插入位点的影响,具有经济实用、适用广泛、操作简便和外源基因在转基因植物中遗传稳定且正常表达等特点。该载体可用于不同基因和不同功能表达载体的快捷构建,为植物的遗传转化和基因功能研究提供了新的通用型基因表达载体工具。     

T7RNAP基因的克隆及其质体定位表达载体的构建

为在番茄成熟果实组织中建立T7/T7RNAP质体转基因特异与高效表达系统,本文克隆了原核T7RNAP基因,在添加上质体定位信号肽编码序列后,由番茄果实成熟特异表达启动子PDS和Tnos终止子控制,构成了含有PDS-ptT7RNAP-Tnos基因表达盒的植物基因双元表达载体。该研究为在番茄质体工程中控制外源质体转基因在番茄成熟果实成熟组织中定点表达奠定了基础。     

拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达

利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。     

AtUGAE4基因反义表达载体构建及对烟草（N.tabaeum L．）的转化

本研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)gDNA中克隆了AtUGAE4基因的家族保守序列片段,反向连接在AtHSP70热激启动子和NOS终止子之间,构成含有该基因反义表达盒的表达载体pV-70brUGAE4,并经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功导入烟草基因组.这为探讨抑制UGAE家族基因表达对植物果胶生物合成和对离体培养细胞的细胞粘连性的影响奠定了基础.     

基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展

基因芯片是以预先设计的方式将大量的生物讯息密码（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA等）固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术本质是生物信号的平行分析,它利用核酸分子杂交原理,通过荧光标记技术检测杂交亲和与否,再经过计算机分析处理可迅速获得所需信息。由于其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点,已引起国际国内广泛的关注和重视,在许多领域得到了广泛的应用。本文简述了基因芯片的概念,技术特点及主要分类,着重对其在基因表达水平检测,基因突变和多态性的分析,基因组DNA分析,后基因组学研究以及转基因农作物检测等方面进行阐述,并说明其存在的问题及展望。     

番茄GRX基因家族的鉴定及表达分析

GRX基因家族是从原核生物到真核生物中普遍存在的一类巯基-二硫键氧化还原酶,在植物的生长发育、器官构建及逆境胁迫和激素信号应答中均发挥重要作用.本研究在番茄基因组范围内,利用生物信息学方法对番茄的GRX基因组家族的成员、分布及结构和功能等进行分析.预测结果显示,番茄GRX家族包含55个蛋白质,分为4个亚族,其中植物特有的CC亚族成员最多,有35个,其他GRX基因成员与拟南芥GRX家族具有相似分类.在番茄GRX结构域中包含12个重要的基序,主要分布在序列的N端,相同亚族中的GRX成员蛋白序列的氨基酸保守域构成基本一致,且各亚族成员的氨基酸保守域组成特异,表明这些基序的存在对GRX蛋白功能的执行是必需的.利用实时荧光定量PCR对番茄GRX基因的组织表达和胁迫响应分析,结果表明,GRX基因具有组织特异性表达差异,CC型在根和花中表达较高,在果实中表达较低;在盐、SA、ABA、高温和低温胁迫条件下,22个番茄GRX基因的表达模式被阐明;其中部分基因的表达水平被显著地诱导增加或者降低,很可能参与了调控番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应.本研究结果将为番茄GRX家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析GRX基因功能奠定基础.     

苹果α-法尼烯合酶基因的启动子序列及同源基因

本文通过设计引物进行PCR扩增α-法尼烯合酶(AFS)基因的5'端区段并测序,获得510bp的‘国光’苹果AFS基因启动子和5'端非翻译区(5'UTR)序列,已在GenBank注册(登录号FJ263961)。序列分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,在转录起始点上游-46bp处有一个TATA盒,-93bp处有一个CAAT盒,-84bp处有一个W盒和-436bp处有一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT。与‘皇家嘎拉’苹果的AFS基因启动子序列(GenBank登录号AY786553.1)比对,本研究发现‘国光’苹果AFS基因启动子序列中有6个碱基(-186T,-207T,-283C,-301A,-413A和-433A)发生变异,‘皇家嘎拉’苹果AFS基因启动子序列相应位置的碱基分别为碱基缺失、-206C、-282G、-300G、-412G和-432G。重要的是,其中‘国光’苹果-413A碱基变异为G发生在一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT中,苹果虎皮病发生和AFS基因的转录表达是否受到这一碱基变异的影响值得进一步探讨。本研究结果还表明,在苹果AFS基因启动子和5'UTR序列中存在一个正向...     

植物基因定点突变与定点置换技术及其在作物遗传改良中的应用

随着大量植物基因组测序工作的完成及EST数据库的充实，利用基因定点突变与定点置换技术精细的研究基因功能是功能基因组学研究的重要手段。同时，基因定点突变与定点置换技术可以克服现有转基因技术的基因沉默和位置效应等诸多缺陷，在植物遗传改良方面具有重要的意义。基因定点突变与定点置换技术在酵母和小鼠胚胎干细胞中已经比较成熟，但在高等植物中同源重组频率非常低，限制了其使用。新近研究发现，利用锌指核酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）引入DNA分子的定点断裂（double-strand breaks, DSBs）可以高效介导基因的同源重组，使得ZFN成为遗传工程的一个研究热点。利用嵌合寡核苷酸(Chimeric oligonucleotides)可以介导基因的单碱基定点突变，在植物遗传改良上有广阔的应用前景。对同源重组相关的调控途径进行基因修饰也可以提高植物的基因打靶效率。植物基因定点突变与定点置换技术难题的攻克，必将加快植物功能基因组研究的步伐，同时给植物基因工程育种带来新的革命。     

TMV-L运动蛋白基因植物表达载体的构建及其与番茄Tm-22基因的互作

对含有烟草花叶病毒番茄株系(TMV-L)部分基因组cDNA的克隆进行缺失改造,得到了含有TMV-L运动蛋白(MP)基因的克隆.MP片段分别与组成型启动子CaMV35S和病原特异诱导型启动子CHS、PiⅡ和BG体外重组,构建成植物表达载体p35S-30K,pCHS-30K,pPiⅡ-30K和pBG-30K.通过农杆菌LBA4404介导,分别转化含Tm-22抗性基因的番茄品种Geneva 80.转化p35S-30K的基因工程植株在苗期观察到了部分坏死和黄化现象,初步证明TMV-L MP与Tm-22存在基因对基因的互作关系.诱导型启动子控制下的MP转基因番茄已得到部分潮霉素抗性愈伤组织,为进一步获得广谱高效抗病植株奠定了基础.     

十字花科黑腐病菌中调控致病相关基因hpaS的XC_2486基因鉴定

十字花科黑腐病菌hpaS影响致病性、HR其编码产物分别与HpaR2、HrpG形成双组分系统。为了深入了解hapS的表达调控机制,本研究将hpaS的启动子与蔗糖敏感基因sacB融合,构建了hpaS的表达报告质粒pL6sacB3670并导入十字花科黑腐病菌野生型菌株8004中,获得了报告菌株8004/pL6sacB3670。然后利用转座子EZ：Tn5对该报告菌株进行诱变,筛选到一株转座子EZ：Tn5插入基因组的克隆。通过测序定位分析发现该克隆是由转座子EZ：Tn5插入到编号为XC_2486的ORF所产生的。然后将hpaS启动子与报告基因gusA融合的报告质粒pL6GUS3670分别导入野生型8004和XC_2486的突变体239C02中,测定比较pL6GUS3670的GUS表达水平,结果显示在突变体背景下GUS表达水平明显比在野生型背景下降低。这表明XC_2486正调控hpaS的表达。对XC_2486突变体239C02进行致病性和过敏反应检测发现,XC_2486与致病性相关,与HR无关。     

优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达研究

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与含有融合杀虫基因（GFMcryIA基因和CPTI基因的融合）表达载体PGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体PGBIF4ABCVHB，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了38株卡那霉素抗性转基因株，经PCR及Southern blotting检测，证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验表明融合杀虫基因表达出的毒蛋白具有杀虫活性，转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8％。实验结果表明：VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达既可使烟草既可增产、又具抗虫性。     

运用病毒载体实现基因治疗

近年来，随着对基因领域的深入探索以及对基因疾病本质的了解，基因治疗应运而生，而基因治疗的疗效，很大程度上依赖于治疗基因在宿主体内发挥作用的时间以及安全性，病毒载体法是目前基因治疗使用较为广泛的方法，该方法可以介导治疗基因在宿主细胞中的稳定存在及长效表达，是基因治疗的一个重要手段。     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果。本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2：flp-35S：ipt及对照载体pBin-hsp18.2：flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除。研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%。在44℃,6h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除。转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%。本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础。