应用鸡全胚细胞培养技术增殖鸡传染性支气管炎H120弱毒的研究

笔者在A·Silim氏等所报道的鸡胚皮肤细胞制备技术的基础上.经改良制备成鸡全胚细胞(CE),并摸索研究了鸡传染性支气管炎(IB)H_(120)株适应此原代细胞培养、感染、增殖和致细胞病变(CPE)的规律.为IBH_(120)细胞弱毒苗的研制提供了依据。     

鸡传染性法氏囊病病毒快速适应鸡胚成纤维细胞的研究

将鸡传染性法氏囊病病毒的鸡胚组织毒或法氏囊组织毒直接在鸡胚成纤维细胞(CEF)上盲传3～13代后。能产生特征性细胞病变效应(CPE)。病毒在含65℃灭能30分钟的犊牛血清的细胞生长液制备的CEF上传代,比在含有56℃灭能的犊牛血清的生长液制备的CEF上传代能早3～5代出现CPE,而得到适应;鸡胚高代毒比鸡胚低代毒更易适应CEF;法氏囊组织毒和鸡胚低代毒对适应CEF的进程没有显著差异。     

传染性法氏囊病疫苗的研究——Ⅰ.传染性法氏囊病病毒2512——弱毒株在鸡胚成纤维细胞培养内的适应

将引自国外的传染性法氏囊病(IBD)—2512鸡胚弱毒成功地适应于鸡胚成纤维细胞(CEF)培养物。该病毒增殖对生长液要求不苛刻,并能对CEF培养物呈现规律性的稳定的致细胞病变作用(CPE);经反复传代及回归鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)重复性试验,都呈现出IBD病毒规律性变化。经毒价测定、安全实验、效力试验证明,该毒株没有因传代和其他因素而改变其特性,其滴度基本稳定在10~(5.50～5.75)EID50/0.2ml,TCID50/0.1ml为10~(7.83～8.17)。     

鸡痘鹌鹑化弱毒在犊牛睾丸细胞上的适应性试验

鸡痘鹌鹑化弱毒不仅能够在鸡胚成纤维细胞上复制,而且经过试验也可以在犊牛睾丸细胞(以下简称BTC)上复制。本试验结果表明：鸡痘鹌鹑化弱毒在BTC上培养传代至第6代后,细胞产毒效价达10^-55EID50／0．2mL左右,达到了《兽用生物制品规程》的制苗标准。这为试验用BTC代替SPF鸡胚生产鸡痘活疫苗提供了重要依据。     

我国鸽新城疫病毒某些生物学特性研究

对我国分离的鸽新城疫坪山毒和川沙毒对鸡胚致死性、鸡胚传代毒的血凝价、对健康鸽致病性以及对鸡胚细胞感染性等一些生物学特性进行了研究和比较,结果表明:二毒株接种鸡胚都能使鸡胚致死,川沙毒致死鸡胚时间略早于坪山毒.二毒株都能在鸡胚传代,鸡胚毒血凝价平均值约2~■.毒株感染鸡胚细胞能规律性地对细胞引起病变作用.对健康鸽都具有致病性,川沙毒致病性指数高于坪山毒,并能引起四周龄肉鸡发病.     

鸡传染性喉气管炎-鸡痘细胞弱毒二联苗的研究

鸡传染性喉气管炎(ILT)和鸡痘(AP)弱毒株能在鸡胚皮肤(CES)细胞中增殖,并引起典型的致细胞病变效应(CPE)。ILT细胞毒含毒量高于鸡胚毒1个滴度(EID_(50)),AP细胞毒含毒量高于鸡胚毒0.79个滴度(EID_(50))。应用鸡胚皮肤细胞同时增殖鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡痘病毒(APV),其细胞毒毒价较单株接毒的细胞毒有所降低,ILTV的含毒量EID_(50)下降0.03个滴度,CCID_(50)下降0.28个滴度,APV的含毒量EID_(50)下降0.24个滴度,CCID_(50)下降0.25个滴度,但仍分别高于鸡胚毒,ILTV EID_(50)比鸡胚毒高0.72个滴度,CCID_(50)高0.93个滴度。APV EID_(50)高0.55个滴度,CCID_(50)高0.17个滴度,其各自的抗原性和免疫原性都不变。将ILT和AP的第3代细胞毒在CES细胞上同时增殖,待细胞出现75％病变对收获、冻融、加入双抗及防腐剂配制成苗。联苗毒对细胞的感染阶分别为CCID_(50) 7.49(ILTV)和CCID_(50) 7.58(APV),以10倍稀释0.2ml剂量肌肉接种鸡,通过11批108只不同月龄鸡的免疫效力检验,对ILT保护率为83.0％,对AP为82.8％,免疫期均在6个月以上。安全可靠。为防制ILT和AP提供了新途径。     

共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒(重组鸡痘病毒vFV282)接种10日龄~11日龄SPF鸡胚,连续传10代,分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞,分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上,连续传8代,对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定。结果表明,重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后,其毒力未返强,F基因和VP0基因未发生缺失和变异。     

鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞上的适应性研究

将鸭肝炎病毒(DHV)E53鸡胚致弱株适应鸭胚成纤维细胞(DEF),连续传代至第16代时出现细胞病变(CPE),第21代时CPE呈现规律性,接毒后72 h CPE达80％,其病变特征是细胞间隙增宽、细胞崩解死亡、脱落.经病毒细胞培养物滴度测定、RT-PCR检测和间接免疫荧光法鉴定,证明DHVE53株能够在DEF上增殖.     

坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株原代毒及其鸡胚传代致弱毒在不同物种细胞中毒性和增殖能力的检测

为了寻找坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)致病机制的研究模型,试验利用实时荧光定量PCR技术检测坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株原代毒CF1及其鸡胚传代致弱毒CF100在不同物种细胞中的增殖情况,并将CF1与CF100分别在鸭胚中传代以检测病毒对鸭胚的损伤情况。结果表明:CF1可在禽类细胞、哺乳类细胞中增殖,但不引起细胞损伤,CF100在禽类细胞、哺乳类细胞中不能增殖,只能在Vero细胞中增殖,且不引起细胞损伤;CF1和CF100在鸭胚中传代发现,传代CF1的鸭胚全身出现明显的出血,但传代CF100的鸭胚未见出血。说明相对于原代毒CF1,鸡胚传代毒CF100对细胞、鸭胚的损伤均降低,具有一定的安全性,可作为坦布苏病毒致病机制的研究模型。     

用免疫胶体金试纸膜快速检测IBDV的研究

用免疫胶体金试纸膜分别检测了GX8／99株超强毒传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)不同传代毒、全国部分省市IBDV地方野毒、鸡胚传代毒、细胞传代毒、临床病料及其他病原材料，试验研究结果表明免疫胶体金试纸膜法与琼脂扩散试验(ACP)相比，具有特异、敏感、快速、简单等特点，不需要特殊的专业技能和其他试剂，能够识别不同的IBDV毒株，包括强毒和弱毒。为IBDV开辟了一条新的、快速的检测途径。     

鸡新城疫Ⅰ系毒在Vero细胞上的传代培养

本文将鸡新城疫Ⅰ系毒在Vero细胞上进行了传代培养。结果表明,鸡新城疫Ⅰ系毒可以适应Vero细胞并能产生明显的细胞病变。虽然其传代培养物的血凝价较低(1∶10～1∶40),但是,其培养物的TCID_(50)值较高,达10~(-9.7)/0.05ml。此外MLD,MDT/MLD和EID_(50)的测定结果也表明,Ⅰ系毒Vero细胞传代毒与鸡胚毒具有相同的毒价。Vero细胞有可能用于鸡新城疫Ⅰ系毒的传代培养。     

冻干种毒在制备鸡传染性喉气管炎和鸡痘活疫苗生产中的应用

生产设苗制备能长期保存且稳定性好、高滴度的生产种毒(种毒批 )是生产的关键。笔者结合生产实际 ,制备了鸡传染性喉气管炎和鸡痘冻干种毒 (种毒批 ) ,实践应用效果很好 ,现介绍给同行以供参考。1　材料和方法1.1　生产种毒鸡痘基础种子由中国兽医药品监察所提供的冻干鸡痘鹌鹑化弱毒Ｆ2 82Ｅ4株。经ＳＰＦ鸡舍提供的ＳＰＦ鸡胚绒毛尿囊膜传代 ,作为生产种毒 ,于 - 2 0℃保存。鸡传染性喉气管炎基础种子由广东生物药厂提供的Ｋ3 17株。经黑龙江省生物制品一厂ＳＰＦ舍提供ＳＰＦ鸡胚绒毛尿囊膜传代 ,作为生产种毒 - 2 0℃保存。1.2　鸡胚由…     

威宁草海黑颈鹤灰鹤新城疫病毒的分离鉴定

本文首次从黑颈鹤和灰鹤自然病例中分离出新城疫病毒(NDV),病毒代号:NDV—C_1(黑颈鹤分离)。NDV—C_2,NDV—C_3(灰鹤分离)。NDV—C_1、C_2、C_3适应鸡胚细胞,并在鸡胚细胞上传代至5代,其毒力致死7日龄雏鸡(非免疫鸡),毒价10~(-7)LD_(50)/ml能致死8日龄鸡胚其毒价为10~(-8)ELD_(50)/0.1m,对鸡胚细胞能产生病变:胞浆膨大,核浓缩并有细胞集落现象。病毒的生物学特性:形态呈球形,有囊膜,纤突和核,病毒粒子大小直径113毫微米,纤毛长约8毫微米。对酸不稳定,核酸型为RNA,能与鸡豚鼠和人的“O”型血球凝集。血清学鉴定结果:新城疫高免血清和康复鹤血清能抑制NDV—C对鸡血球的凝集,禽流感免疫血清则不能抑制,抑制效价分别为128~x和32~x。通过8日龄鸡胚中和试验。鸡新城疫免疫血清中和NDV—C,其中和指数为1862,用50％终点中和计算法,中和指数>50。用新城疫Ⅰ系苗免病40日龄鸡测对NDV—C和保护率,结果对NDV—C_1 9/10保护,对NDV—C_2~10 O/10,对NDV—C_3 10/10保护。鉴定结果:NDV—C_1、C_2、C_3均属副粘病毒属中的新城疫病毒。     

共表达NDV F和IBDV VPO基因重组鸡痘病毒遗传稳定性研究

将共表达NDV F和IBDV VP0基因重组鸡痘病毒(重组鸡痘病毒vFV282)接种10日龄～11日龄SPF鸡胚,连续传10代,分别对第5、8、10代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282接种鸡胚成纤维细胞,分别对第1、5、10、15、20、25、30代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定;重组鸡痘病毒vFV282翅翼刺种于鸡体上,连续传8代,对第3、5、8代传代毒进行病毒毒价测定和PCR鉴定.结果表明,重组鸡痘病毒vFV282在SPF鸡胚上传10代、在SPF鸡胚成纤维细胞传30代、在鸡体传8代后,其毒力未返强,F基因和VP0基因未发生缺失和变异.     

鸡全胚成纤维细胞在鸡痘细胞活疫苗生产中的应用

采用鸡胚全部组织(全胚法)制备鸡胚成纤维单层细胞和采用鸡胚部分组织(常规法)制备鸡胚成纤维单层细胞生产了鸡痘细胞活疫苗,接毒后均产生大量的感染多核细胞和典型细胞融合性病变(胡椒粒样).鸡胚效价检测表明,鸡痘细胞苗和鸡痘组织苗均可引起鸡胚绒毛尿囊膜水肿、增厚或痘斑,但鸡痘细胞苗产生痘斑数量明显高于鸡痘组织苗.鸡体刺种结果表明,鸡痘细胞苗诱发的免疫反应(发痘)好于鸡痘组织苗;与常规法相比,全胚成纤维单层细胞制备方法可提高鸡胚利用率2倍以上.全胚法也可应用于制备其他鸡成纤维细胞疫苗.     

接种鸡传染性喉气管炎、鸡痘二联细胞弱毒鸡的血清中和抗体测定

接种鸡传染性喉气管炎(ILT)和鸡痘(AP)弱毒鸡胚皮肤(CES)细胞培养物的鸡.经不同时间采血进行ILT和AP中和抗体测定,血清中ILT和AP中和指数明显增高,ILT·AP-CES细胞毒以10~(-1)0.2ml肌肉注射比0.1ml点眼、滴鼻鸡的血清中和指数高;ILT-AP二联细胞弱毒对鸡具有良好的应答反应.为制备ILT-AP细胞弱毒二联苗提供了依据。     

猪传染性胃肠炎病毒的分离试验

猪传染性胃肠炎(简称TGE)是由一种病毒引起的猪的急性传染病。1956年Fee和Efo等报导该病毒可在猪肾细胞培养物上传代,1963年Harada首次报导了TGE病毒在猪肾细胞培养物上能出现细胞病变(CPE)(1)。也有报导(2)TGE病毒可在鸡胚、猪肾细胞、猪脾细胞和狗肾细胞培养物内传代增殖。     

IBDV不同野毒株鸡胚传代及各变异代次回归鸡后的致病性

对分离于河南省的YX08、YX12、YB02等3个传染性法氏囊病毒（IBDV）野毒株进行了鸡胚适应性培育,对各代病毒进行了生物学试验,并对其VP2高变区基因进行了RT-PCR扩增和序列分析。结果显示,各毒株随传代次数的增加,与经典毒株Cu-1及弱毒株P2的同源性有所增高;各毒株的变异代次和变异位点不尽相同,但232、233、234及253位氨基酸的密码子在传代过程中是易变密码子;各毒株对鸡胚的半数致死量随着传代均降低了2～3个稀释度;鸡胚中病毒的滴度在10代以后较传代初期均有提高。接种供试雏鸡后,各毒株的鸡胚毒出现的临床症状均较其法氏囊毒晚24～36 h,致死率有所下降,但各毒株鸡胚毒与其囊毒病理变化相似。     

犬瘟热病毒的分离及部分特性研究

本试验通过消除组织培养中某些干扰因素,用鸡胚成纤维细胞(CEF)直接从水貂病料中分离出3株犬瘟热病毒,即QM—CDV、YM—CDV和ZM—CDV,并以3株国外犬瘟热弱毒作为参考株,对所分离毒株的部分生物学特性进行了研究.结果表明,QM—CDV、YM—CDV和ZM—CDV在鸡胚成纤维细胞上生长良好,产生明显的细胞病变(CPE),也可在猴肾传代细胞(Vero)和人羊膜细胞(FL)上增殖并出现细胞病变;在电镜下观察,病毒粒子具有囊膜和纤突,直径在130～180nm之间;细胞中和试验表明,分离毒与国外弱毒具有相同的血清型;分离毒株的水貂病料经脑内接种均使幼犬发病,出现明显的临床症状.     

鸡痘鹌鹑化弱毒活疫苗生产工艺改进试验

优化鸡胚成纤维细胞(CEF)培养鸡痘鹌鹑化弱毒细胞苗的生产工艺中,采用同步接毒法即在制备鸡胚成纤维细胞时同时接毒和异步接毒法即鸡胚成纤维细胞形成单层以后接毒,两种方法进行对比。结果以同步接毒法可以降低生产成本,缩短细胞培养的时间,简化工艺。