一株猪肺炎支原体的分离鉴定

从全国部分猪场采集到疑似猪支原体肺炎肺组织病料12份,提取DNA进行猪肺炎支原体PCR和多重PCR检测,将病料研磨后分离猪肺炎支原体,最终分离到1株疑似猪肺炎支原体;通过测序分析、形态观察、生化试验、血清学试验证实其为猪肺炎支原体。该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养活菌滴度达109CCU/m L;菌株有一定的致病性,免疫原性好,可作为疫苗备用菌株,该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎疫苗奠定了基础。     

一株猪肺炎支原体HN0613株的分离鉴定

采集疑似猪支原体肺炎病理变化的肺脏,经Friis液体、固体培养基培养、纯化,PCR、测序分析、生化鉴定、生长抑制、代谢抑制和致病性试验证实分离获得一株猪肺炎支原体菌株,命名为HN0613.该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养达108 CCU/mL;菌株有较强的毒力,可作为疫苗候选株进一步研究.该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎灭活疫苗奠定了基础.     

猪肺炎支原体的培养和保存

我们从外地引进几株猪肺炎支原体标准株和流行株,并从慈溪疫区分离出一株猪肺炎支原体,对其继续培养方法和菌株保存方法进行了一些工作,介绍如下:     

猪肺炎支原体DJ-166株的分离鉴定

从山西某猪场采集疑似猪支原体肺炎肺组织病料,接种CH培养基培养,克隆纯化获得一株菌株。该菌株经PCR、培养特性、生化特性和血清学特性试验鉴定为猪肺炎支原体,命名为DJ-166株。该分离菌株在人工合成培养基上传8代稳定后,活菌计数达到108CCU/m L;菌液培养物气管注射猪后,致病性较弱;免疫原性试验证明该分离菌株具有良好的免疫原性,此结论为猪支原体肺炎疫苗的研究提供了必要条件。     

不同厂家猪血清配制的培养基培养猪肺炎支原体的比较研究

根据培养物的生长速度和含菌量方面筛选适合猪肺炎支原体CJ株生长的猪血清。配制改良Friis培养基时分别添加6种不同生产厂家的猪血清,由6种不同厂家猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株。从生长时间可知,由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基更适宜猪肺炎支原体CJ株的生长。从测定的含菌量测定结果可知,由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的含菌量较高。结果表明,由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间短且含菌量高。     

猪肺炎支原体YN200901株的分离鉴定

采集疑似猪肺炎支原体病理变化的肺脏,接种到改良牛心培养基、猪胃消化液培养基进行培养,经瑞特染色、镜检,菌落狄氏染色、PCR鉴定及序列比对、生化试验鉴定,抗猪肺炎支原体血清生长抑制试验,分离获得一株猪肺炎支原体云南地方流行菌株,命名为YN200901。试验结果为云南本地株猪肺炎支原体的后续研究提供了物质基础。     

内蒙古地区绵羊肺炎支原体的分离鉴定及序列分析

本试验无菌采取内蒙古地区某发病羊场的绵羊病变肺脏组织,接种于支原体液体培养基进行分离培养后获得1株支原体,根据分离株的培养特性、形态学观察及生化试验等,初步鉴定为绵羊肺炎支原体。然后提取分离株的基因组,用通用引物体外扩增出分离株16S rRNA序列,将该序列与GenBank中已知33种支原体序列进行比较,结果表明该序列与绵羊肺炎支原体标准株Y-98的16S rRNA序列的同源性为99%,鉴定该分离株为绵羊肺炎支原体。     

猪肺炎支原体强毒株HNMhy1的生物学特性研究

猪肺炎支原体菌株HNMhy1分离自发生典型呼吸困难、肺脏发生实变的保育猪,在PPLO液体培养基中增殖滴度高,达109CFU/mL以上。HNMhy1株具有稳定的生物学特性,对保育猪具有较强的致病力,能够引起保育猪发生典型的喘气病症状,且具有良好的免疫原性。用猪肺炎支原体菌株HNMhy1制备的疫苗安全,对猪的支原体肺炎具有较好的保护效果,可以作为疫苗备用菌株,为猪支原体肺炎疫苗的研制奠定了基础。     

3种支原体培养基对猪肺炎支原体CJ株培养效果的比较分析

通过猪肺炎支原体CJ株接种3种猪肺炎支原体培养基后的生长活性研究发现,与其他2种培养基相比,接种改良Friis培养基培养2~3 d含菌量可达到1.0×109~10CCU/m L,具有生长迅速、含菌量高的特点,可用于猪肺炎支原体CJ株的培养。     

猪肺炎支原体强毒株的分离和鉴定

从15份疑似猪支原体肺炎病料中分离出病原,然后进行培养传代,再做染色镜检、PCR鉴定、序列分析和动物回归实验,最终将分离株接种于健康仔猪,结果仔猪出现典型的猪支原体肺炎临床症状和病理变化,证明该分离株为猪肺炎支原体.     

猪肺炎支原体CJ株膜蛋白的电泳分析和免疫印迹检测

以在新疆昌吉某猪场分离的一株猪肺炎支原体(CJ)为试验材料,采用SDS-PAGE和Western-Blot印迹对该菌的膜蛋白进行了分析。该猪肺炎支原体(CJ)经过Friis改良液体培养基培养,以12 000 r/min离心收集菌体,低温反复冻融获得膜蛋白后,应用12%分离胶,4%浓缩胶进行SDS-PAGE分离,在电泳图谱上呈现大概26条蛋白条带,分子量在10 k D~200 k D。再以膜蛋白做免疫印迹检测,其Western-Blot膜上有14种反应条带,其中p36、p38、p40、p52、p65,p70、p114、p200条带颜色较深。     

从猪喘气病的病肺中分离到两株猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)N_3,N_5株的研究

1976年从猪喘气病的病肺中分离到两株支原体培养物。在液体培养基中生长迅速,菌体以姬姆萨染色呈紫色小点状多形态。固体培养基上生长小圆球状菌落,中间有一小突起。鸡胚卵黄囊内接种,7至10天后,出现心包炎。实验感染三周龄仔猪,腹腔内接种能诱发典型的多发性浆膜炎。作者曾暂定为猪鼻支原体。后经上海畜牧兽医研究所进行生长抑制试验鉴定,N_3和 N_5株与猪鼻支原体国际标准首株 BTS_7栋为同种(10)。所以 N_3和 N_5株应为我国首次分离的猪鼻支原体菌株,并证实我国猪喘气病病猪的病肺中也存在着猪鼻支原体。     

猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术研究

肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻,是疫苗规模化生产的工艺难题。本文针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术进行研究。通过培养试验筛选四种培养基配方表明该疫苗株在低血清改良培养基中生长良好;优化发酵培养工艺,使其在发酵罐培养60～70 h的峰值可达到1010CCU/mL;设计筛选该疫苗耐热保护剂和冻干工艺,37℃下保存10 d的耐老化试验结果显示,下降滴度小于100.5CCU/mL。本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。     

猪肺炎支原体高密度发酵工艺的研究

为提高猪肺炎支原体发酵培养的滴度,在500L发酵罐基础上,对猪肺炎支原体J株的发酵工艺进行了一系列优化试验,各项发酵培养条件经优化后,发酵支原体的滴度得到了明显提高,发酵滴度可达到1×109CCU/ml以上,本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础.     

猪血清对猪肺炎支原体培养影响的研究

正一、材料(一)菌株1.猪肺炎支原体P-5722-3株,由美国硕腾动物保健公司提供,哈药集团生物疫苗有限公司保藏。2.猪肺炎支原体P-5722-3株CCU阳性标准品(CCU检测),由美国硕腾动物保健公司提供,哈药集团生物疫苗有限公司保藏。(二)完全培养基1.培养基组分A:根据猪肺炎支原体P-5722-3株培养基配方要求,制备组分A。2.培养基组分B:猪血清3.猪肺炎支原体P-5722-3株完全培养基由培养基组分A与培养基组分B共同制备,培养基组分A由哈药     

致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppF基因序列分析

本研究旨在调查新疆喀什某规模化奶牛场的犊牛死亡原因,并确定病原体.无菌采集3份因肺炎死亡的犊牛肺脏病料样品.采用牛支原体专用液体培养基和1.0%牛支原体琼脂固体筛选培养基从3份病死犊牛肺脏病料中分离得到2株牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis),分别命名为M.bovis-NJ-1和M.bovis-NJ-2.通过菌落形态学观察、特异性PCR和oppF测序比对对分离株进行鉴定.结果显示,2个分离株在固体培养基上的菌落呈现典型的"煎蛋状",且Dienes染色特点符合牛支原体菌落着色特征,中心呈深蓝色;PCR能扩增出牛支原体特异的448 bp目的片段;2个分离株的oppF基因序列与牛支原体国际标准株PG45的同源性分别为96.7%和95.3%.结果表明,引起犊牛发病死亡的病原是牛支原体,本研究为犊牛支原体肺炎的快速诊断和防制提供依据.     

猪肺炎支原体检测芯片的研制及初步应用

本研究探索建立一种新的基因芯片方法检测和鉴定猪肺炎支原体。在猪肺炎支原体的16SrRNA、P36和P463个基因内设计3个靶基因片段,用PCR标记Cy3探针,建立了用于检测和鉴定猪肺炎支原体的检测芯片。试验结果显示,猪肺炎支原体与检测芯片的3个靶基因（Mhp-16S、Mhp-P46和Mhp-P36）杂交呈阳性,猪鼻支原体只与Mhp-16S靶基因杂交呈阳性,其它所测细菌和病毒不与检测芯片的靶基因杂交。检测芯片的检测灵敏度和PCR相同,能达到10pg基因组DNA／50μL标记体系或反应体系。用检测芯片鉴定了3株疑似猪肺炎支原体临床分离株,结果有2株为猪肺炎支原体,1株为其它猪支原体。用检测芯片、P36-PCR和分离鉴定分别对45头病猪临床样品选择混合培养物中的猪肺炎支原体进行了检测,结果它们的检出率分别为20％（9／45）、22．2％（10／45）和8．9％（4／45）。检测芯片还检出有26．7％（12／45）的病猪感染了其它猪支原体。试验结果表明,所建立的检测芯片是一种快速检测和鉴定猪肺炎支原体的敏感特异性方法。     

猪肺炎支原体膜蛋白的电泳分析及免疫印迹检测

以猪肺炎支原体Z株为试验材料,采用SDS-PAGE和Western印迹对该菌膜蛋白进行了分析。研究表明:猪肺炎支原体经A_(26)液体培养基培养,15000 r/min离心收集菌体细胞,低渗超声法破膜获得膜制剂后,应用12.5％的凝胶对膜蛋白进行SDS-PAGE分离,在电泳图谱上呈现出36条蛋白带,相对分子质量范围为1.18×10~4～9.12×10~4。同时以膜制剂作为抗原,分4次免疫试验兔,心脏采血,提取抗血清,并分离纯化得到IgG,然后进行Western印迹法检测。其结果发现在SDS-PAGE分离得到的36种膜蛋白(或多肽)中,有6种蛋白具有免疫原性。     

猪喘气病病原菌的分离鉴定

<正>猪气喘病,又称猪支原体肺炎,猪地方性肺炎,是由猪肺炎支原体(Mycolasma hyopneumoniaw,Mhp)引起的一种猪慢性、接触性呼吸道传染病,具有气喘和咳嗽、患病猪只生长缓慢和发育不良等特点。Mhp经常与圆环病毒等其他肺部病原体混合感染,易造成更大的经济损失。本研究从发病猪病料中分离、鉴定获得了1株猪肺炎支原体,为该病病原研究提供了基础。从猪喘气病病例中分离得到1株病原菌,对病原菌进行分离培     

山羊源精氨酸支原体的分离鉴定与药感试验

本实验的目的是从患有呼吸道疾病的山羊中分离支原体。采集13个病羊鼻腔棉拭子,接种于支原体液体培养基中,37℃、5%CO2培养6d,采用16Sr RNA通用引物检测支原体属PCR方法进行检测,阳性样本转移固体培养基分离鉴定并进行药敏试验。结果显示,从13份液体培养基中检测出5株支原体,经16Sr DNA序列分析证实为精氨酸支原体,遗传进化分析表明,5株精氨酸支原体独立的聚为1支。在固体培养基上分离得到2株支原体,药敏试验结果显示对红霉素、盐酸土霉素、酒石酸泰乐菌素、氧氟沙星、硫酸头孢喹诺、恩诺沙星、林可霉素、硫酸庆大霉素、头孢噻呋、硫酸链霉素10种抗生素敏感,对氟苯尼考耐药。本实验从患呼吸道病的山羊中成功分离出精氨酸支原体,鉴于该菌是人的致病菌,其公共卫生学意义值得进一步关注。