单细胞转录组测序技术及其在植物研究中的应用

为探究单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)在植物研究中的应用,本综述对单细胞转录组测序技术的发展状况进行了总结,介绍了其在胚胎发育、免疫细胞、肿瘤领域以及植物研究的运用.其次,就单细胞转录组测序技术中的要点技术(单细胞分离技术、单细胞全转录组cDNA扩增技术、高通量测序技术)进行了总结分析.最后,本文根据植物细胞...     

单细胞测序技术发展及其在作物研究中的应用

作物同一组织中的细胞往往被认为是具有相同状态的功能单位,传统的检测手段分析的是细胞群体的总体平均反应。而单细胞测序是在单个细胞水平对基因组或转录组进行测序分析的技术,通过对单个细胞的DNA或RNA进行测序,表明组织系统层面的功能是由异质性细胞构成的,在解决生物异质性和生物材料的低获取量等问题上具有独特优势,极大改变了人们对许多生物现象的理解。本综述概括了当前单细胞测序技术发展、测序原理、测序流程以及在作物研究中的应用,并对当前已经取得成果的应用领域进行了阐述,以期为作物单细胞测序的研究与应用提供参考。     

植物单细胞分离与转录组学分析研究进展

细胞异质性是多细胞生物体中普遍存在的现象.通过分离单细胞,并对其进行转录组分析,有助于准确而深入地理解细胞分化、信号转导等生物学过程及相关的基因调控网络.目前动物细胞的相关研究已取得显著进展,而植物由于存在细胞壁,显著增加了细胞分离的难度及基因表达数据的准确度,限制了植物单细胞转录组测序的研究进展.本研究综述了几种有较...     

基于转录组测序筛选黄牛低氧适应性相关差异基因

为探明藏黄牛对低氧适应的相关差异表达基因并分析差异表达基因功能和代谢通路,以藏黄牛和三江黄牛心脏组织为研究对象,提取总RNA,建立测序文库后利用Illumina HiSeqTM 4000进行测序,经生物信息学分析筛选出差异表达转录本,并对差异表达基因进行GO富集和KEGG通路分析,最后采用荧光定量PCR(RT-qPCR)验证测序数据的准确性。结果表明:藏黄牛相比于三江黄牛得到显著差异表达基因608个,其中上调基因467个,下调基因141个,推测表达量较高的B2M、COX7C、NFATC1、ECE1、CAST基因是与低氧适应性相关的基因;差异转录本GO功能富集分析可知,在分子功能、细胞组分、生物过程分别富集到327,253,2 191个条目,其中富集程度最高的条目分别是细胞发育过程、结合与转录因子活性、细胞前缘。KEGG分析结果表明,差异转录本显著富集在8条通路,筛选低氧适应性候选基因NFATC1是MP-PKG信号通路与T细胞受体信号通路成员,推测其通过cGMP-PKG通路与T细胞受体信号通路参与低氧适应性调控。采用高通量测序技术对藏黄牛和三江黄牛心脏组织进行转录组测序分析,获得大量差异...     

乌拉尔甘草转录因子GlMYB84的克隆及其过表达分析

为了探析转录因子GlMYB84在调控甘草黄酮类化合物合成过程中的作用,克隆并对其表达情况与甘草黄酮合成之间的关系进行分析。根据前期转录组测序结果,用PCR方法扩增获得GlMYB84基因的全长cDNA序列并进行生物信息学分析,亚细胞定位确定其编码蛋白在细胞中的位置。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测GlMYB84基因在各个组织中及不同生长阶段的表达量,过表达后检测甘草黄酮的含量。结果首次在甘草中克隆到GlMYB84基因,其cDNA序列包含1个1 167 bp的ORF,共编码341个氨基酸,在细胞核中发现编码的蛋白质。GlMYB84的表达水平在甘草根中较高,且随着植株的生长而增高。黄酮的含量与基因的表达量呈正相关。本研究为植物细胞培养技术工业化生产甘草黄酮类化合物提供了参考理论依据。     

银杏褐化与非褐化愈伤组织的转录组分析

本研究利用环境扫描电子显微镜和高通量测序技术对银杏褐化和非褐化愈伤组织进行细胞结构观察与转录组测序,以探索愈伤组织的褐化机理。扫描电镜观察显示非褐变的愈伤组织细胞排列均匀,褐变愈伤组织的细胞表现出紊乱,排列松散无序。对褐化和非褐化愈伤组织共计6个样品进行了转录组测序,共获得45.66 Gb Clean Reads,各样品Clean Reads均达到6.41 Gb以上。对褐化与非褐化愈伤组织的基因进行差异分析,结果发现分别有275和153个基因上调和下调表达。转录因子分析发现相较于非褐化愈伤组织,褐化愈伤组织中MYB、AP2和NAC等转录因子表达量上调,HD-ZIP下调。KEGG功能富集分析结果表明差异表达基因显著富集在苯丙烷代谢途径,PAL和CCR基因上调表达增加了酚酸的合成与代谢,推测苯丙烷生物代谢途径部分基因表达量上调导致酚酸类化合物的积累,可能是银杏愈伤组织褐化的主要原因。本研究通过扫描电镜观察和转录组测序,为解析银杏愈伤组织褐化的分子机制提供理论依据。     

植物响应干旱的转录组学研究进展

转录组测序技术,能从mRNA水平全面地研究物种基因功能及特定的生物学过程,利用该技术能研究植物在干旱逆境下所有基因的表达水平情况,有助于揭示植物对干旱的应答机理。本研究综述了利用转录组技术揭示的干旱胁迫下植物信号转导、内源激素、光合作用、活性氧清除、渗透调节、次级代谢、细胞壁构建等途径中的差异基因表达情况,并展望了今后的研究趋势,以期为植物干旱研究提供参考。     

基于RNA-Seq的彩色马铃薯MYB转录因子家族分析

植物MYB转录因子是功能多样、数量众多的转录因子之一,对植物的生长发育和代谢调控起着极其重要的作用.本研究基于彩色马铃薯块茎转录组测序数据,对彩色马铃薯发育过程中MYB转录因子基因进行筛选,并对其保守结构域、亚细胞定位进行分析;同时利用TMEV软件对其中R2R3-MYB转录因子的差异表达进行分析,并对差异显著的R2R3-MYB转录因子进行功能预测.结果 表明,基于转录组测序数据,筛选得到143个彩色马铃薯MYB类转录因子基因,根据结构特征分为4大类:1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB;亚细胞定位结果显示,138个MYB转录因子定位于细胞核,4个定位于细胞膜,1个定位细胞质;保守域分析显示,R2R3-MYB类转录因子的保守基序为R2、R3;彩色马铃薯R2R3-MYB转录因子基因在不同时期差异表达,其中上调表达10个、下调表达5个;根据GO富集性分析,共注释到6个和花青素相关的R2R3-MYB转录因子,本研究为下一步彩色马铃薯花青素合成相关MYB基因生物学功能和代谢调控机制的研究提供参考.     

基于RNA-Seq的彩色马铃薯MYB转录因子家族分析

植物MYB转录因子是功能多样、数量众多的转录因子之一,对植物的生长发育和代谢调控起着极其重要的作用.本研究基于彩色马铃薯块茎转录组测序数据,对彩色马铃薯发育过程中MYB转录因子基因进行筛选,并对其保守结构域、亚细胞定位进行分析;同时利用TMEV软件对其中R2R3-MYB转录因子的差异表达进行分析,并对差异显著的R2R3-MYB转录因子进行功能预测.结果 表明,基于转录组测序数据,筛选得到143个彩色马铃薯MYB类转录因子基因,根据结构特征分为4大类:1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB;亚细胞定位结果显示,138个MYB转录因子定位于细胞核,4个定位于细胞膜,1个定位细胞质;保守域分析显示,R2R3-MYB类转录因子的保守基序为R2、R3;彩色马铃薯R2R3-MYB转录因子基因在不同时期差异表达,其中上调表达10个、下调表达5个;根据GO富集性分析,共注释到6个和花青素相关的R2R3-MYB转录因子,本研究为下一步彩色马铃薯花青素合成相关MYB基因生物学功能和代谢调控机制的研究提供参考.     

基于转录组学的安格斯牛和中国西门塔尔牛脂肪沉积相关差异表达基因研究

为探明安格斯牛和中国西门塔尔牛脂肪沉积的相关差异表达基因,以其背膘组织为研究对象,提取总RNA,建立测序文库后利用华大BGISEQ-500进行测序,经生物信息学分析筛选出差异表达基因,并对差异表达基因进行GO功能富集和KEGG通路分析,最后采用荧光定量qPCR(qRT-PCR)验证转录组测序数据的准确性。中国西门塔尔牛对安格斯牛转录组数据结果显示有1 296个差异表达基因,其中上调基因802个,下调基因494个;对转录组数据的GO功能富集分析结果显示在生物过程、分子功能、细胞组分分别富集到2 205,890,3 149个条目,KEGG通路分析结果表明,差异基因显著富集在6个分支上。对其中与脂肪沉积相关的cAMP通路进行分析,筛选出与脂肪沉积相关的差异表达基因3个,分别为DKKL1、ACACB和PTGS2,并通过qRT-PCR对基因DKKL1、ACACB和PTGS2进行了验证,初步确定其为脂肪沉积的候选基因。通过对中国西门塔尔牛和安格斯牛的背膘组织测序获得的大量差异表达基因,为后续对脂肪沉积相关基因的筛选奠定了基础。     

转录组测序技术在植物水淹胁迫研究中的应用

水淹胁迫是植物遭受的主要非生物胁迫之一,对作物生长发育、产量、品质等都会带来严重影响,全面解析植物的耐涝机制,对选育耐涝品种具有重要意义。高通量转录组测序技术以其数字化信息、高灵敏度、广泛的检测范围及重复性好等优点,已被广泛用于生物体的多种功能研究。目前在水稻、玉米、油菜、黄瓜、大豆等多个物种中,已有从转录水平分析植物对水淹胁迫的分子响应机制相关研究报道,这对于深度解析植物耐涝的分子响应机制和加快作物耐涝品种选育具有重要意义。但目前尚未有转录组测序技术在植物水淹胁迫应用方面的综述。因此,本研究着重综述了植物水淹胁迫测序组织及时间点选择、各阶段基因表达水平、GO功能富集、小RNA的功能特征几个方面,并展望了新一代测序技术在植物抗逆机理研究中的应用前景。     

与甘蔗间作的花生叶片转录组分析

为研究间作甘蔗对花生相关基因的表达调控及响应机制,以花生叶片作为材料,使用Illumina NovaSeq 6000高通量测序技术,对间作花生离甘蔗较近的边行(IPA_leaf)、间作花生离甘蔗较远的中间行(IPB_leaf)及单作花生(MP_leaf)叶片进行转录组的测序分析。将各样本获得的转录组数据进行两两比较,MP_leaf_vs_IPA_leaf、MP_leaf_vs_IPB_leaf和IPB_leaf_vs_IPA_leaf的差异表达基因数分别是1 806个、968个、1 302个,其中上调表达基因分别占61.13%、48.24%、65.05%。GO功能富集分析显示差异表达基因主要涉及细胞壁组织或生物合成、碳水化合物生物合成与代谢过程、细胞多糖生物合成与代谢过程、细胞葡聚糖生物合成与代谢过程、催化活性、氧化还原酶活性及过程等。KEGG富集分析表明差异表达基因主要涉及的代谢通路有苯丙素类生物合成、α-亚麻酸代谢、淀粉和蔗糖的代谢、类黄酮生物合成等。本研究通过花生叶片转录组分析,为研究间作花生叶片基因的表达调控机制提供基础数据资料。     

金花葵不同组织的转录组测序及分析

为了获得金花葵转录组信息,研究其功能基因的表达,本试验采用Illumina Hiseq 2500转录组高通量测序技术对金花葵不同组织的转录组进行测序,从差异表达基因中鉴定与黄酮类化合物合成的相关基因。研究结果表明,共获得97.64 Gb有效数据,各样品有效数据均为5.81 Gb,Q30碱基百分比在92.73%及以上。经过组装后共获得52 990条Unigene,其中39 651条被注释。通过KEGG分析,发现不同组织中黄酮类化合物生物合成的基因表达均有较大的变化。检测出单碱基重复至六碱基重复类型的SSR位点4 322个。本试验分析了金花葵各组织参与黄酮类化合物合成的相关基因,为进一步研究金花葵次生代谢产物合成的功能基因挖掘与利用提供充足的理论依据。     

植物转录因子的超表达及其在分子育种中的应用

植物在生长发育过程中经常遭受到许多生物和非生物因素的胁迫,需要通过对基因的调控来适应,而转录因子在植物的生长发育和防卫反应的表达调控中有着非常重要的作用,因此需要对转录因子的功能进行深入的研究。为了研究转录因子的功能,一系列的反遗传学工具随之发展起来,包括超表达、反义抑制、基因敲除等,而最为普遍的则为基因敲除技术与超表达技术。本文对基因敲除与超表达进行了比较和对比,阐述了转录因子独特的特性和作用模式以及超表达策略,总结了各种以超表达为基础的方法学,包括组成型表达、组织特异性表达、化学诱导表达等,并说明了超表达后如何进行分析。然后结合转录因子超表达的转基因应用方面分析了其在分子育种上的应用前景。     

青狗尾草Dof基因家族的全基因组鉴定及组织特异性表达分析

青狗尾草是禾本科狗尾草属的一种草本植物,随着基因组测序的完成,青狗尾草逐渐发展成为抗旱耐逆研究的模式植物。Dof(DNA binding with one finger)是植物特有转录因子基因家族之一,在植物生长发育的一系列生理生化反应过程中发挥重要作用。本研究对青狗尾草Dof转录因子基因家族的基因在染色体上的位置、基因结构、编码蛋白的理化性质和系统发育等方面进行分析。此外,还对该基因家族成员在不同的组织器官、发育阶段的表达进行了分析。研究结果发现青狗尾草基因组中存在36个Dof基因,命名为Sv Dof1~Sv Dof36。通过对青狗尾草、谷子、高粱、水稻和拟南芥Dof蛋白的系统发育关系分析,Dof基因家族可被分为6个亚组(Group 1~6)。利用狗尾草转录组数据,进一步研究了狗尾草Sv Dof基因在10中不同组织器官中的表达情况,结果显示Sevir.8G018500和Sevir.1G022000基因只在胚芽鞘中表达,Sevir.8G184900在叶分生组织和花序分生组织中呈现特异性表达,预示着这些Dof基因可能参与特定组织的发育。本研究结果为下一步鉴定Sv Dofs基因功能提供基础。     

猪毛菜不同部位转录组特征分析

本研究以猪毛菜的地上部分和地下部分为实验材料,通过转录组测序分析探讨猪毛菜不同组织部位的基因表达特征和代谢物质形成有关的基因调控。测序数据分析结果显示获得192 777条转录本序列。差异表达筛选得到14 424个差异基因,其中上调表达基因6 137个,下调表达基因8 287个;GO功能富集分析得到14 424个差异基因。差异基因与KEGG数据库进行比对,共有5 169个差异基因注释在138个通路上,其中参与次生代谢途径共11条通路呈显著性富集。进一步分析黄酮类化合物合成和异喹啉生物碱生物合成通路中的差异基因和其对应的相关酶。随机选取了黄酮类化合物合成通路上的8个基因,通过RT-qPCR分析验证了转录组数据的准确性。本研究利用高通量测序技术和生物信息分析获得猪毛菜不同部位的转录组信息特征,为猪毛菜的药用成分研究和基因功能鉴定提供了科学依据。     

马铃薯R2R3-MYB转录因子的克隆及植物表达载体的构建

MYB转录因子家族是植物转录因子中最大的家族之一,广泛参与植物初生和次生代谢调控、细胞形态的建成、环境胁迫的应答等。前期转录组测序表明抗晚疫病的马铃薯材料加湘1号接种晚疫病菌后其MYB基因家族中的一个R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243的表达量显著上调。为了探讨R2R3-MYB转录因子PGSC0003DMG400011243在马铃薯晚疫病抗病过程中发挥的作用。本研究通过PCR扩增了加湘1号中的该基因,并通过XcmⅠ酶切、连接将其装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-JX-R2R3,并转化到农杆菌GV3101中。该研究为R2R3-MYB转录因子的基因转化及后续的功能分析提供了理论指导。     

中国红豆杉中WRKY转录因子基因克隆及其对紫杉烷合成的调控

WRKY是一类专一结合W-box序列的转录因子,它对植物抗病、损伤、衰老等生物学过程起到调控作用,尤其是在植物次级代谢物质合成中起到了重要调控作用。本研究采用中国红豆杉细胞转录组数据库序列设计引物,从中国红豆杉基因组中克隆转录因子基因TcWRKY26,该基因大小为2 202 bp;构建pBI121超表达载体,转化农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导转化红豆杉细胞,继而基于RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,发现转录因子基因明显超表达,相对表达量提高了2.92～3.49倍,紫杉烷合成相关酶dbat基因也有明显的超表达,相对表达量提高了1.78～2.03倍,说明TcWRKY26基因对dbat基因有明显的上调作用,继而为构建高产、稳定的红豆杉基因改良细胞株提供参考依据。     

矮生稷山牡丹的性状鉴定及转录组差异分析

为探究稷山牡丹矮化机理,本研究以矮生稷山牡丹和高株型杨山牡丹的茎段为材料,通过石蜡切片技术进行细胞学观察,利用转录组测序技术分析两种材料茎段的差异基因,并进行RT-qPCR验证。细胞学观察结果显示：稷山牡丹的细胞长度显著短于杨山牡丹,而细胞宽度和密度显著大于杨山牡丹;通过转录组测序并进行差异基因的筛选,获得122 336个差异表达基因,其中69 364个基因表达上调,52 972个表达下调。KEGG通路富集发现,与矮生性状相关的基因主要富集在脂肪酸途径和植物激素信号转导途径。筛选13个矮生相关候选基因进行RT-qPCR验证,其结果与转录组结果一致。本研究旨在从细胞及分子水平解析牡丹株高性状,挖掘其相关基因,为揭示稷山牡丹的矮生机理以及利用矮生相关的优异基因来改善株型提供了理论依据。