华丽龙胆花青素合成酶GsANS基因的克隆及其表达分析

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素苷生物合成途径末端的关键酶。本研究以华丽龙胆(Gentiana sino-ornata) 5个不同开放阶段(H₁～H₅)花冠及根、茎、叶为试材,采用RT-PCR技术从花冠H₂阶段分离出了华丽龙胆花青素合成酶基因GsANS的全长序列,利用生物信息学软件分析其序列信息,通过RT-qPCR技术分析表达模式。结果显示GsANS开放阅读框为1 086 bp,编码362个氨基酸,含有PcbC结构域和2OG-FeⅡ-Oxy保守结构域。系统进化分析表明,其与三花龙胆花青素合成酶氨基酸序列相似性高达91.23%,亲缘关系最近。对不同开放阶段花冠及根、茎、叶中GsANS的表达模式进行分析,结果显示GsANS在花冠中表达量均高于根、茎、叶中的表达量,同时在花冠发育的H₄阶段GsANS的相对表达量达到最高值,随后降低,推测Gs ANS基因参与华丽龙胆花冠花青素苷的合成。本研究可为解析华丽龙胆花冠中花青素苷生物合成的分子调控机理提供科学依据。     

兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因的克隆及其表达特性

克隆同色兜兰二氢黄烷酮醇-4-还原酶基因DFR,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。采用RT-PCR和RACE技术从花中克隆DFR的全长cDNA,用生物信息学方法分析序列特征,并用半定量RT-PCR研究其在不同组织的表达。分离到DFR,该cDNA全长1267 bp,具有1个1074 bp的完整开放阅读框,编码357个氨基酸。序列分析表明,该DFR蛋白含有1个NADB_Rossmann superfamily保守结构域,1个NADP(H)结合域和1个底物特异性结合域,其与文心兰、石斛兰和大花蕙兰等的DFR同源性在75%~80%。系统进化树显示,该DFR蛋白与兰科植物的DFR蛋白亲缘关系比较近。半定量RT-PCR表明,该DFR在成熟花和营养叶中的表达量最高,在子房、苞叶、萼片和花瓣中的表达量相当,在唇瓣中的表达量次之,在蕊柱中的表达量较唇瓣中的低,在花茎中的表达量最低,在根中几乎检测不到。原核表达结果表明,该DFR在大肠杆菌中获得表达。从兜兰中克隆到花色代谢途径中的关键酶基因DFR,该基因可能参与调控花色素的合成。     

毛果杨YABBY基因家族生物信息学分析

YABBY基因家族是仅存在于植物中的一类含有C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域的转录调控因子,与植物的形态发育有关,在植物的茎、叶和花等器官的生长发育过程中起到重要的调控作用。本研究通过对毛果杨(Populus trichocarpa) YABBY基因家族生物信息学分析,共筛选出12个YABBY家族成员,分别位于第1、2、3、6、8、9、10、14、16和18号染色体。这些成员结构域保守,且具有低亲水性的特点。通过亚细胞定位预测,所有成员都定位在细胞核中。基因组织表达分析表明,毛果杨YABBY家族成员在不同组织中的表达有明显不同,在雌花、雄花和芽中表达量较高。     

籽粒苋AhNAD-ME的序列特征与表达

NAD(P)-苹果酸酶催化苹果酸氧化脱羧,产生丙酮酸和CO₂,伴随NAD(P)的还原。在C₄植物中,苹果酸酶参与了C₄光合作用。本研究对克隆的双子叶C₄植物籽粒苋NAD-苹果酸酶基因(AhNAD-ME)编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析,结果表明, AhNAD-ME具有苹果酸酶的完整功能域,包括苹果酸N端结构域和苹果酸酶的NAD结合结构域;进化树表明, 该序列属于NAD-ME的α亚基,该亚基定位于线粒体基质中。半定量RT-PCR分析表明,该基因主要在叶片和茎中表达,表达量随光照时间延长而增加。将AhNAD-ME基因重组到原核表达载体pEASY-E1中,电击法转化到大肠杆菌Transette (DE3)菌株中,IPTG诱导其高效表达,表达的融合蛋白的分子量与预期相符,主要以包涵体形式存在。     

大豆GmHDL57基因的克隆及抗盐功能鉴定

HD-Zip I类转录因子在植物抵御非生物胁迫过程中发挥重要功能, 本研究克隆得到1个大豆HD-Zip I类基因GmHDL57 (Glycine max homeodomain-leucine zipper protein 57)。序列分析表明, GmHDL57基因包含1个1038 bp的开放读码框, 编码345个氨基酸, 具有HD-Zip类家族蛋白典型的保守结构域。基因时空表达分析表明, 大豆GmHDL57基因在大豆植株的各个不同时期及不同器官中均有表达, 在花中表达量最高。采用实时荧光定量PCR技术分析了4种非生物胁迫(脱落酸、NaCl、PEG、冷)对幼苗期大豆根中GmHDL57基因表达的影响。结果表明, 该基因表达量受高盐胁迫诱导显著升高, 在脱落酸及干旱胁迫下上升幅度较小, 但在冷胁迫下呈下降趋势。盐胁迫前后GmHDL57基因在根中的表达量明显高于茎和叶, 在盐胁迫48 h时达到峰值, 72 h和96 h时表达量缓慢下降。此外, 构建GmHDL57基因的植物超表达载体, 利用根癌农杆菌转化法获得转基因百脉根, 200 mmol L ^-1 NaCl处理条件下, 转基因百脉根的株高、根长、叶绿素含量、根系活力以及阳离子K ⁺、Ca ²⁺含量显著高于野生型, 而丙二醛含量、相对质膜透性以及Na ⁺的含量明显低于野生型。以上研究结果表明, GmHDL57基因参与了大豆对非生物胁迫的应答过程, 过量表达GmHDL57基因能够显著提高百脉根的抗盐能力。     

多胺氧化酶(PAO)调控光诱导玉米中胚轴伸长的生理机制

以长中胚轴玉米自交系PH4CV为材料,在黑暗和光照两种处理条件下研究了玉米中胚轴长度与多胺氧化酶(Polyamine Oxidase, PAO)活性、H₂O₂含量、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性及木质素含量的关系。通过添加5 mmolL^-1 PAO抑制剂2-羟乙基肼(2-hydroxyethylhydrazine, 2-HEH)和5 mmolL^-1 H₂O₂清除剂N,N’-二甲基硫脲(N,N’-Dimethylthiourea, DMTU)及组织化学染色,研究了影响中胚轴伸长的H₂O₂来源及其积累部位。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,探究了光对ZmPAO基因表达的影响。结果表明,光照处理显著抑制了玉米中胚轴的伸长,同时显著增加该部位的PAO活性、H₂O₂含量、POD活性及木质素含量。相关性分析表明,玉米中胚轴长度与PAO活性、H₂O₂含量和木质素含量呈极显著负相关,与POD活性呈显著负相关;PAO活性与H₂O₂含量、POD活性和木质素含量均呈正相关。外源PAO抑制剂和H₂O₂清除剂处理试验,玉米中胚轴表皮纵切面细胞长度显微观察及中胚轴H₂O₂组织化学染色表明,PAO氧化分解多胺(Polyamines, PAs)产生的H₂O₂参与了中胚轴细胞伸长的生理调控,从而抑制了中胚轴的伸长。表达分析表明,ZmPAO基因在黑暗环境下的表达量相对稳定,光刺激0.5 h后表达量迅速升高,3 h后达到最大值,随后逐渐下降,10 h后趋于稳定。本研究表明,PAO在接受光刺激后活性升高,氧化分解PAs产生H₂O₂,从而诱导POD氧化胞壁的单木质醇并聚合为木质素,使细胞壁硬化,造成细胞伸长受阻。研究结果为进一步探讨PAO活性调控光诱导玉米中胚轴伸长的生理机制和阐明玉米中胚轴对光逆境的响应机理提供了理论依据。     

甘薯扩展蛋白IbEXPA2基因克隆和表达分析

扩展蛋白(Expansin)是细胞壁的重要组成成分,参与细胞壁的舒张,与植物器官生长发育密切相关。甘薯是一种块根类作物,其块根不仅是繁殖器官,也是储能器官,因此,开展甘薯块根生长膨大机理研究具有重要意义。本研究在前期转录组学研究基础上,克隆到一个可能与块根膨大相关的扩展蛋白基因IbEXPA2,并进行生物信息学和qPCR表达分析。生物信息分析表明,IbEXPA2编码253个氨基酸,包含DPBB＿1和Pollen＿allerg＿1结构域,具有一段信号肽及23个氨基酸的跨膜结构域。该基因编码的蛋白与三裂叶薯expansin-A4蛋白(登录号:XP＿031109781.1)的同源性最高,为98.03%;时空表达分析表明该基因在甘薯品种‘西瓜红’和‘桂经薯8号’块根中表达显著高于纤维根,‘西瓜红’生长的各个时期块根中表达均显著高于茎和叶,在移栽50 d时表达量最高,为对照纤维根的8.49倍;‘桂经薯8号’生长多数时期在块根中的表达也显著高于茎和叶,在移栽35 d时表达量最高,为对照的8.11倍。推测该基因参与甘薯块根生长膨大调控。     

芥菜型油菜BjuB.KAN4基因调控类黄酮的途径

MYB类转录因子KAN4有调控植物原花青素合成的功能。为了探究芥菜型油菜中MYB转录因子KAN4对原花青素合成的调控机理,本研究以芥菜型油菜紫叶芥为实验材料,克隆了一个BjuB.KAN4基因,编码266个氨基酸,BjuB.KAN4蛋白包含一段高度保守的MYB-like DNA结合结构域,属于1R-MYB转录因子家族成员。基因表达分析表明, BjuB.KAN4在根中表达量显著高于叶和茎中, GUS组织化学染色分析试验推测,该基因可能在根茎叶的维管组织中表达。利用毛状根体系过表达BjuB.KAN4发现,类黄酮合成途径的部分关键酶基因Bju.CHS和Bju.DFR等的表达量在紫叶芥和四川黄籽的转基因根系中均显著增加,紫叶芥转基因根系中总黄酮含量为2.798 mg g^-1,是对照组的1.3倍,四川黄籽中总黄酮含量为2.567 mg g^-1,是对照组的1.2倍。在拟南芥中异源表达BjuB.KAN4发现,转基因植株总黄酮含量为0.237mgg^-1,是野生型的1.5倍,原花青素含量为0.363mgg^-1,较野生型...     

豹皮樟纤维素合酶基因家族的鉴定与表达分析

纤维素合酶基因在初生细胞壁和次生细胞壁的合成中发挥着不同的作用,影响着豹皮樟纤维素含量以及老鹰茶的品质。本试验应用生物信息学方法,从豹皮樟中鉴定出17个纤维素合酶(CesA)基因,根据系统进化关系将这些基因分为7个亚组,进行了基因结构、染色体定位和不同部位基因表达分析。结果表明,所有基因均具有纤维素结构域,且不均等地分布在染色体上;RNA-seq数据分析表明,LcoCesA1＿1/3＿2/3＿5/3＿1/3＿3/2＿2在各个组织中表达较为显著,在根、茎以及其他部位中相对表达量普遍最高的是LcoCesA3＿1,推测其在纤维素合成中发挥着重要作用。研究表明,该家族蛋白相对分子量为18 834.17～128 366 kD之间;理论等电点(pI)介于5.07～8.74之间,一半以上的LcoCesA蛋白富含酸性氨基酸。     

天蓝龙胆草的试管开花及花后管理

天蓝龙胆草(Gentiana sinoornata)别名华丽龙胆,是龙胆科龙胆属多年生草本植物。高10～20cm;地下根状茎肉质,多条;茎匍匐状,基部分枝多,斜升,无毛;叶对生,条形或长圆状披针形;花单生,近无柄,天蓝色,长约5～6cm;花期9～11月。产云南丽江、维西、中甸(香格里拉)、贡山     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

CBL互作蛋白激酶GmCIPK10增强大豆耐盐性

盐胁迫严重威胁大豆产量和品质。类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(CIPKs)在植物应对环境胁迫过程中发挥重要作用。但是,目前对大豆CIPKs的生物学功能知之甚少。本研究从大豆基因组克隆到GmCIPK10。生物信息学分析结果表明,GmCIPK10属于不含内含子型CIPKs,包含一个丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶结构域和NAF/FISL基序。表达模式分析结果表明,在盐(NaCl)、甲基紫精(MV)和过氧化氢(H₂O₂)处理下,GmCIPK10的转录水平升高。在拟南芥和大豆毛状根中过表达GmCIPK10能够提高转基因植株的抗盐性。进一步的生理指标测定发现,在盐胁迫下,过表达GmCIPK10能够降低转基因植株中丙二醛(MDA)和H₂O₂积累,增强抗氧化酶活性以及降低钠离子(Na⁺)/钾离子(K⁺)比值。此外, qRT-PCR分析发现GmCIPK10促进抗氧化和耐盐相关基因表达响应盐胁迫。酵母双杂交、Pull-down和双分子荧光互补试验结果证明GmCIP...     

普通菜豆镰孢菌枯萎病抗病相关基因PvCaM1的克隆及表达分析

钙调素蛋白(calmodulin,CaM)作为植物细胞内介导多种功能的Ca²⁺结合蛋白,在调节植物的生长发育和抗病性方面具有重要作用。利用普通菜豆(Phaseolus vulgaris L.)表达序列标签(EST)克隆了含有编码普通菜豆CaM基因的cDNA序列。序列分析表明,cDNA片段长713 bp,命名为PvCaM1,具有一个453 bp的开放阅读框(ORF),GenBank登录号为JN418801,该基因编码150个氨基酸,预测蛋白质分子质量为17.16 kD。蛋白质结构分析表明,PvCaM1蛋白含有4个Ca²⁺结合结构域(EF-hand)。同源分析结果显示,PvCaM1基因与百脉根、西瓜的CaM基因亲缘关系最近,分别达到77%和76%。荧光定量PCR分析表明,PvCaM1基因受尖孢镰孢菌菜豆专化型FOP-DM01菌株诱导表达,接种病原菌96 h,抗病品种260205根中PvCaM1基因的表达量达到最高,而感病品种BRB-130达到最低,260205叶中PvCaM1基因的表达量均高于BRB-130,而且叶中的表达量高于根和茎中的表达量。PvCaM1基因表达量也受外源植物激素脱落酸、茉莉酸甲酯和乙烯利诱导上调,在根、茎、叶中均有不同程度的表达。本研究表明PvCaM1基因可能通过脱落酸、茉莉酸和乙烯等信号途径参与菜豆对FOP-DM01菌株的防御反应,推测菜豆PvCaM1基因与镰孢菌枯萎病的抗病性有一定关联。     

灌水量和种植密度的配置对干热河谷紫甘蓝生物量分配、产量及水分利用效率的影响

为了揭示灌水量和种植密度配置下干热河谷紫甘蓝(Brassica oleracea var.capitata rubra)产量形成机理,研究了不同灌水量5800 m3/hm2(I₁)、4900 m3/hm2(I₂)、4600 m3/hm2(I₃)和不同种植密度79200株/hm2(D₁)、52800株/hm2(D₂)、39600株/hm2(D₃)配置对紫甘蓝生物量特性、产量和水分利用效率的影响。结果表明：灌水量对紫甘蓝植株外叶鲜重、茎鲜重和茎比例有显著影响,灌水量减少降低了外叶-地上生物量的异速生长指数,紫甘蓝将更多的生物量分配到外叶中。随着种植密度的降低,紫甘蓝外叶鲜重、茎鲜重、叶球鲜重、外叶生物量、茎生物量、叶球生物量和总生物量均显著增加,外叶比例显著降低,叶球比例增加,生物量异速生长关系变化不明显。影响紫甘蓝生物量特性的主要因素是种植密度,灌水量影响较小,其交互作用不显著。I₂D₃处理的生物量特性主成分分析得分最高,灌溉水利用效率最高,经济产量较高。这表明,I₂D₃处理为紫甘蓝最佳灌水量和种植密度。本研究结果可为干热河谷紫甘蓝高产高效生产提供理论依据。     

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。     

茄子SmWRKY53基因克隆与生物信息学及表达分析

本研究从茄子‘特旺达’幼苗在高温下转录组及基因表达检测数据中,筛选出对高温胁迫响应明显的Sm WRKY53基因,并对其进行克隆和生物信息学及初步表达分析。序列分析显示,Sm WRKY53基因的开放阅读框为1 083 bp,编码360个氨基酸。结构域分析显示,Sm WRKY53第138到144个氨基酸含有一个典型的“WRKYGQK”保守结构域,锌指结构为C₂HC型,属于GroupⅢ亚家族。对其进行同源性比对及系统进化树分析发现,Sm WRKY53与马铃薯(Solanum tuberosum) St WRKY53亲缘关系最近,同源性高达91.41%。生物信息学预测显示,Sm WRKY53为碱性不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,其蛋白的二级结构元件中无规则卷曲比例最高,达63.89%,且存在氨基酸无序化结构区,亚细胞定位预测该蛋白最可能定位于细胞核内。RT-q PCR分析表明,Sm WRKY53在茄子成熟茎中的相对表达量最高,在果肉中表达量最低。高温胁迫下,茄子幼苗的根、茎和叶中Sm WRKY53表达量先升高后降低,且在3 h达到峰值。本研究为进一步探究SmWRK...     

牛大力漆酶基因CsLAC17的克隆与载体构建

为研究漆酶在牛大力生长发育过程中的生物学功能,本实验以牛大力叶片为材料,从反转录PCR获得的cDNA中扩增出漆酶基因CsLAC17全长。序列分析表明,CsLAC17 c DNA全长为2 010 bp,开放阅读框大小为1 755 bp,编码一个由584个氨基酸组成的蛋白质。结构域分析表明,Cs LAC17蛋白的保守结构域具有漆酶典型结构域的特征——铜离子结合域(Cu-oxidase和Cu-oxidase-2)。同源序列分析表明,Cs LAC17蛋白序列与绿豆(Vigna radiata var. radiata)和野生大豆(Glycine soja)同源性为88%、藜豆(Mucuna pruriens)87%、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 85%。组织特异性表达分析显示,CsLAC17在茎中表达量最高,叶中表达量次之,根中较少。此外,进一步构建了pBI121-CsLAC17过表达载体并转入农杆菌。本研究为日后CsLAC17基因的功能验证以及为牛大力开展分子生物学研究提供帮助。     

外源过氧化氢对烟草花芽分化的影响初探

通过盆栽试验,对外源H₂O₂处理的烟草活性氧代谢及烟草花芽分化情况进行了初步研究。结果表明：（1）外源H₂O₂处理显著影响了烟草体内活性氧代谢,H₂O₂和O₂ ^-含量迅速增加;保护酶POD和CAT活性迅速被激活,SOD的激活滞后于POD和CAT。喷施H₂O₂处理的中后期H₂O₂的含量下降。（2）外源H₂O₂胁迫改变了开花基因的表达、现蕾时烟草叶片数以及花芽的发育进程。5和15d的外源H₂O₂处理明显抑制了烟草FLC基因的表达,促进了LFY基因的表达,促使烟草花发育提前。试验结果表明烟草体内活性氧平衡状态的变化影响烟草的花发育进程。     

甘薯IbCAF1基因的克隆及耐盐性、抗旱性鉴定

CAF1 (CCR4-associated factor 1)基因在植物发育、抗病等方面发挥着重要的作用。本研究根据前期获得的差异表达EST序列,克隆得到甘薯IbCAF1基因。IbCAF1基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为846 bp,编码281个氨基酸,分子量为32.13 kD,等电点为4.83。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明, IbCAF1与甘薯近缘野生种Ipomoeatriloba(2x)同源蛋白ItlCAF1有较高的同源性,序列一致性为96.8%。IbCAF1基因受到NaCl、PEG、ABA和H₂O₂的诱导表达。利用根癌农杆菌介导法将IbCAF1基因转入烟草,过表达IbCAF1基因显著提高了转基因烟草植株的耐盐性和抗旱性。在200 mmol L^-1 NaCl和10%PEG-6000的胁迫下, IbCAF1基因的过表达显著上调了转基因烟草植株中活性氧清除系统和脯氨酸合成相关基因的表达,增加了SOD活性、POD活性、脯氨酸含量,降低了H₂O_2<...     

利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因

为了鉴定可能的小麦抗光氧化基因,利用大麦条斑病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统,对6个小偃54响应强光的基因进行了沉默表达研究。以BSMV:GFP植株为对照,分析了这些基因的减量表达植株在低温强光、DCMU、MV及H₂O₂等处理下的PSI最大光化学效率(F_v/F_m)和光合性能指数(P.I.)、MDA含量及整株生物量变化。结果显示,Ta23008和Ta92165均参与小麦对低温强光、DCMU、MV和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta106078参与小麦对DCMU、MV和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta27787参与小麦对低温强光、DCMU和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta24695参与小麦对低温强光和H₂O₂胁迫的响应过程;而Ta119251仅参与小麦对DCMU的响应过程。此外,Ta23008、Ta92165、Ta106078、Ta119251四个基因被抑制表达后,其转化株系的生物量比对照显著降低,推测其可能参与调控小麦生物量的积累。