棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析

为了克隆棉花抗黄萎病相关基因,利用生物信息学、病毒诱导基因沉默技术(VIGS)、实时定量PCR(q PCR)和接菌分析来研究棉花WRKY基因对大丽轮枝菌的诱导响应和抗性。结果从棉花中筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因,这些直系同源WRKY基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导响应。其中有6个GhWRKY基因的表达均受到大丽轮枝菌诱导上调,而GhWRKY70和GhWRKY48的表达量随着不同的时间点呈现上调或下调。GhWRKY22等5个基因表达量在24,72 h分别表现为上调,呈现出双峰曲线。对GhWRKY22表达特征进一步分析,结果显示,GhWRKY22基因在茎里优势表达,同时表达受到大丽轮枝菌、水杨酸和茉莉酸激素的诱导。GhWRKY22基因沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性增加,抗病标志基因(PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1. 2)表达量也显著降低,揭示GhWRKY22是通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应过程。总之,棉花中8个WRKY基因参与棉花对黄萎病抗性调控,其中GhWRKY22基因正调控棉花的抗性,可作为棉花抗病育种的候选基因。     

棉花冠菌素不敏感因子GhCOI1基因分离和对大丽轮枝菌的抗性分析

为了解决黄萎病对棉花的危害,利用基因工程技术培育抗病棉花品种是当前育种的主要目标。从棉花中克隆了一个黄萎病抗性基因GhCOI1,其编码冠菌素不敏感因子。GhCOI1基因序列全长2 213 bp,编码一个600氨基酸的多肽,分子量为68 k Da,等电点p I是7.06。GhCOI1含有典型的F-box和LRR结构域。组织表达分析表明,该基因在根器官优势表达,并且其表达受到大丽轮枝菌浸染诱导。利用病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术,抑制了GhCOI1基因在棉花植株中的表达;通过大丽轮枝菌接菌分析表明,GhCOI1基因沉默能够引起植株的抗性下降,发病加重。研究结果表明GhCOI1参与棉花对大丽轮枝菌抗性调控,因此,其可以作为棉花抗病育种的候选基因。     

GhWRKY48负调控棉花对大丽轮枝菌的抗性

为了防治棉花黄萎病对棉花生产的危害,利用抗病基因培育抗病品种是最经济有效的方法。从陆地棉中克隆了1个WRKY转录因子基因,命名为GhWRKY48;其编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为32.68 ku和6.10。qPCR组织特异性表达分析结果表明,GhWRKY48在根、茎和叶中均表达,而在茎中为优势表达;同时GhWRKY48表达受到大丽轮枝菌、茉莉酸和水杨酸的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术获得GhWRKY48基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示,沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。综上所述,GhWRKY48是一个负调控转录因子,抑制下游抗病基因的表达,从而参与棉花对大丽轮枝菌的抗性;因此,GhWRKY48基因可以作为一个理想的候选基因用于棉花的抗病育种。     

科技与产品

正中科院微生物所在大丽轮枝菌侵染机制研究中取得进展大丽轮枝菌是一种土传病原真菌,通过侵染植物的根进入维管束定殖,在世界范围内引起严重的黄萎病害。在我国棉花黄萎病素有"棉花癌症"之称,严重制约我国棉花生产,并造成巨大的经济损失。由于大丽轮枝菌从根部侵染,是否像叶际病原真菌(如稻瘟菌)一样,     

中科院微生物所在棉花与黄萎病菌互作研究中取得新进展

<正>棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传维管束病害,是制约我国棉花生产的首要病害。从棉花黄萎病抗性品种中发掘关键抗病基因,进而通过分子育种与传统育种相结合的方法提高主栽品种的黄萎病抗性,是当前棉花领域基础和应用研究的重点。质外体是植物细胞膜外由细胞壁和细胞间隙组成的系统,是植物抵御病原菌侵染的第一道屏障,在植物先天免     

用相互嫁接和定量PCR分析棉花对棉花黄萎病的抗性

为了研究棉花对棉花黄萎病的抗性机制, 本文选用对棉花黄萎病表现抗病的海岛棉(Gossypium barbadense)材料海7124和Pima 90及感病的陆地棉(G. hirsutum)材料冀棉11, 通过相互嫁接的方法构建试验系统, 用棉花黄萎菌对其人工接种, 利用Real-time quantitative PCR (qPCR)技术分析其在感病和抗病棉花中侵染的差别。相互嫁接试验中感/抗和抗/感组合的病情指数介于感/感和抗/抗对照之间, 且相互嫁接棉株各个部位的IC值(侵染系数)也多介于其对照相应部位之间; 并且病情指数与不同部位IC值显著相关, 说明棉花黄萎菌可以通过接口在抗-感之间扩展。感/抗嫁接组合试验说明抗病材料的茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用, 而抗/感类型试验说明抗病材料接口以上部分也具有抑制病原菌增殖的作用。总之, 抗病海岛棉无论作为砧木还是接穗, 都能有效抑制病原菌的扩展, 说明抗病海岛棉对棉花黄萎菌具全株抗性, 但茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用; 同样, 感/抗和抗/感组合试验也说明感病材料的各个部位均不能抑制病原菌的定殖和扩展。     

贝莱斯芽孢杆菌SZAD1对大丽轮枝菌的生物防治效果

【目的】黄萎病是棉花的主要真菌病害,缺乏高抗品种和安全有效的化学杀菌剂。生物防治黄萎病对棉花生产具有重要意义。本研究旨在探讨棉花内生细菌对大丽轮枝菌的拮抗活性和生物防治潜力。【方法】通过16S r DNA与gyr B序列分析,对菌株SZAD1进行鉴定。在平板对峙试验中检测SZAD1对黄萎病菌VD080菌丝生长的抑制能力,通过种子浸泡和灌根检测对黄萎病的防效。制备含羧甲基纤维素或几丁质的琼脂平板培养基来检测菌株能否分泌纤维素酶和几丁质酶,并用二硝基水杨酸试剂法测定酶活性。【结果】SZAD1属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。SZAD1菌株能显著抑制VD080菌丝生长,种子浸泡法和灌根法处理中SZAD1菌株对棉花黄萎病的防效分别为60.10%和56.00%。SZAD1菌株能产生纤维素酶和几丁质酶,在培养72 h时达到最大酶活性。该菌发酵72 h的上清液抑菌效果最强。加入25 mg·L~(-1)和50 mg·L~(-1)的SZAD1发酵上清液后,液体马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的VD080孢子含量分别较对照降低了30.20%和96.53%。【结论】SZAD1菌发酵上清液通过灌根法处理可减少VD080在棉花植株茎部的定植,减轻棉花叶片枯萎程度。SZAD1有作为生防菌控制棉花黄萎病的潜力。     

中国农科院加工所研究揭示棉花抗黄萎病的分子遗传结构

<正>研究所戴小枫研究员领衔的科研团队发表了首个基于简化基因组测序的棉花黄萎病抗性全基因组关联分析的研究结果,发现了14个抗病新位点,揭示了棉花多基因协同控制黄萎病抗性的分子遗传规律。棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的头号生产病     

棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

几种氨基酸铜对大丽轮枝菌微菌核形成的抑制作用

大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)是引起棉花黄萎病的病原菌,它能以其休眠体微菌核的形式在土壤中长期存活,并保持对寄主的侵染力。Bell等认为真菌的微菌核黑色素具有抵抗自然界紫外光辐射和土壤微生物侵袭的功能,不少学者认为大丽轮枝菌的微菌核黑色素与菌株致病力有关,黑色素受抑制的菌株致病力降低。外界环境,如温度、杀菌剂等影响大丽轮枝菌微菌核和微菌核色素的形成。近年来,复合氨基酸铜作为一种新型的杀菌剂已有很多报道。本实验室最早把复合氨基酸铜用于防治棉花黄萎病,并研究了甘氨酸铜对棉花黄萎病株的过氧化物酶、多酚氧…     

病原物协同致病性对棉花黄萎病严重度的影响

大丽轮枝菌是1种土传的维管束病原菌,由其引起的棉花黄萎病是我国棉花生产上最重要的病害之一。而最近发现了1种土壤习居的机会病原真菌棉帚霉菌能通过伤口侵入寄主,并与大丽轮枝菌协同加重棉花黄萎病严重度。棉帚霉菌能在营养非常贫乏的基质中产生分生孢子;超微结构观察也证实该病原菌在维管束组织中存在,并能产孢,显示了该真菌具有维管束病原菌的生物学特性。另外,土壤中的线虫活动可能使棉花根部产生伤口,也能促进病原菌的侵染。在总结分析生物学特性、侵染与互作机制等研究进展的基础上,提出建立棉花根围多病原物与寄主互作体系可深入研究棉帚霉菌与大丽轮枝菌协同致病机制的观点。     

新疆乌苏地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为了研究新疆乌苏地区棉花黄萎病菌的致病型和群体间的变异性,从该地区不同棉株上分离8株病原菌,通过对病原菌的菌落培养形态、菌丝和孢子的显微结构、对寄主的致病性、ITS序列的克隆、菌株间的系统进化及营养亲和性分析等方面进行了研究。结果表明：分离的病原菌均属于非落叶型棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),为大丽轮枝菌;系统进化树显示8株菌在系统进化上属于2个不同的进化方式;8株黄萎病菌在相同的寄主上致病性存在差,Vd-1菌株致病力最强,Vd-34致病力最弱;不同致病力的菌株之间的营养亲和性分为2个营养亲和群(VCGs)。新疆乌苏地区棉花黄萎病的致病菌是大丽轮枝菌,病原菌在进化上差异显著。     

棉属D基因组3个野生棉种Bet v1基因鉴定及功能分析

【目的】对棉花D基因组中Bet v 1基因家族进行分析,比较其在不同抗性棉种间的表达模式差异,为深入研究Bet v 1基因在棉花抗黄萎病中的作用提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法对D基因组中Bet v 1基因进行鉴定。通过雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)、三裂棉(G. trilobum,D8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D1)转录组和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析Bet v 1基因在黄萎病菌处理下的表达模式。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对Bet v 1基因进行功能鉴定。【结果】[棉花D基因组中包含59个成员,其中57个基因带有内含子,分布于8条染色体上,多数为亲水性蛋白并定位于细胞质。]黄萎病菌胁迫条件下3个野生棉种的Bet v 1基因表达量与其抗病水平一致。将不同表达水平的基因分为3组,其中第3组基因响应黄萎病菌侵染并在抗病棉种瑟伯氏棉中高表达,表明该组基因可能与黄萎病胁迫应答反应有关。从中筛选出高水平表达的Bet v 1基因,在陆地棉中沉默相应的同源基因,棉株感病加重,揭示该基因在棉花抵御黄萎病菌侵染过程中起正调控作用。【结论】响应黄萎病菌胁迫的Bet v 1基因在棉花抗黄萎病复杂的生物过程中至关重要。本研究结果为棉花Bet v 1家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析棉花Bet v 1基因的功能奠定基础。     

抗黄萎病海岛棉叶片在大丽轮枝菌胁迫下的蛋白组学分析

【目的】探讨海岛棉抗黄萎病材料的抗病机理,寻找可能的抗病基因。【方法】以高抗黄萎病海岛棉材料长312为试材,利用蛋白质双向凝胶电泳和质谱鉴定技术探讨棉花在大丽轮枝菌胁迫下蛋白质水平的变化。【结果】在接种大丽轮枝菌2 h后,长312叶片中有11个蛋白表达水平下调,15个蛋白表达水平上调;下调表达的蛋白主要是与光合作用及碳同化相关的一些酶类,推测大丽轮枝菌危害棉花叶片主要是破坏其光合系统;表达水平上调的蛋白主要是一些与光合作用、碳同化相关的酶类及苯醌还原酶、β-D-半乳糖苷酶、14-3-3f蛋白等抗病蛋白。【结论】推测海岛棉对黄萎病的防御机制发生在2个层面:一是被动防御,可能通过叶绿体ⅡA-B结合蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶等下调蛋白的同工蛋白上调表达保持抗病海岛棉光合系统的稳定,通过组蛋白和14-3-3f蛋白的高表达保持抗病海岛棉植株细胞的稳定性;二是主动防御,可能通过高表达β-D-半乳糖苷酶和苯醌还原酶等参与海岛棉的抗病反应。     

河南省棉花黄萎病菌致病力测定初报

引起棉花黄萎病的病原菌大丽轮枝菌在棉花上存在致病力强弱不同的菌株。Schnathorst 根据菌株对3个棉花品种(DPL、Acala 4—42、Tanguis 2855)致病力测定结果,证明致病力强弱显著不同。Bredikhina 依据在不同棉花品种(108—F     

大丽轮枝菌混合侵染棉花的研究

利用绒毛型变异体 (B型 )的形态特征 ,采用不同形态类型的菌株混合接种、再分离后分别进行致病力和营养体亲和性测定的方法 ,证明不同致病力的大丽轮枝菌菌株可以共同侵染同一株植物 ,在菌株间不同浓度混合比例的接种中 ,混合侵染率约占总侵染率的 1 /1 5至 1 /3。是一种研究不同致病力的菌株在寄主体内互作动态和分布情况的简便方法。由此提出在黄萎病研究中为防止不同致病力菌株对研究结果的干扰 ,应以使用单孢菌株为宜 ;由于形态变异体容易识别 ,在研究棉花黄萎病的交叉保护现象中可加以利用     

北京萝卜萎蔫病病原鉴定及病原生长影响因子

2009年北京郊区发生一种萝卜(Raphanus sativus L.)新病害,其主要症状表现是叶子黄化萎蔫,生长受阻。针对该病的发生,作者采集典型发病植株进行病原菌的分离纯化,用传统的形态学方法和rDNA-ITS序列分析方法进行病原鉴定,并进一步对病原菌生长影响因子进行研究,以便为该病的进一步深入研究、抗病种质资源的筛选和抗病品种的选育打下基础。研究认为该病由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起。该病原菌生长适宜温度为20~25℃,适宜pH为6~8,该病原菌能够很好地利用多种氮源和碳源,氮源以硫酸铵最为适宜,碳源则已可溶性淀粉最适宜。这是首次报道由大丽轮枝菌侵染引起的萝卜黄萎病在中国的发生。     

土壤中棉花黄萎病菌微菌核的定量检测

由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是新疆棉花最主要的病害之一。大丽轮枝菌产生的微菌核是造成黄萎病的初侵染来源和主要的存活结构。本试验通过运用选择性培养基定量检测棉田土壤中棉花黄萎病菌的微菌核的量,探明棉花黄萎病菌在不同时期土壤中的动态变化过程及主要分布区域。试验结果表明,棉田土壤中黄萎病菌微菌核主要存在于0~40 cm的耕作层中,土壤中微菌核的数量与棉花的生长季节有一定的相关性,苗期土壤中的微菌核数量相对较低,从蕾期开始逐渐增加,到花铃期和吐絮期数量达到最高值。微菌核在棉田耕作层中的垂直分布并不均匀,土壤中微菌核的季节变化与田间棉花黄萎病病害发生趋势高度一致。     

棉花GbSTK基因调控开花和黄萎病抗性的功能研究

棉花是重要的经济作物,实现既抗病又早熟是棉花重要的育种目标,但棉花抗病与早熟基因之间的关联性研究报道甚少。本课题组前期鉴定到一个响应黄萎病菌诱导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GbSTK,可以提高转基因拟南芥的黄萎病抗性。本研究发现多个抗病棉花品种中STK基因的表达量显著高于感病对照品种H208。在抗病品种农大601中沉默STK基因,沉默植株在接菌后20d,其黄萎病抗性显著降低,病情指数由27.5(耐病)升高到63.2(感病),表明该基因正向调控棉花黄萎病抗性。对转GbSTK基因拟南芥表型鉴定发现,其开花时莲座叶片数平均为7.5个,显著低于空载体对照植株(11.9个),转基因植株开花时间较对照平均提早5~7 d。进一步对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现,转基因不同株系中FT和SOC1的表达水平显著高于对照植株,而LFY基因的表达受影响较小,表明STK基因可以影响开花关键基因FT和SOC1的表达,进而调控植株提早开花。基于酵母双杂交互作蛋白筛选试验,初步获得30个与GbSTK具有互作关系的候选蛋白,为进一步揭示GbSTK的分子调控网络奠定了基础。本研究首次鉴定出可同时提高黄萎病抗性和提早开花的一个功能基因,为棉花抗病早熟遗传改良提供了参考依据。     

转基因抗虫棉抗黄萎病鉴定及黄萎病发生规律

采用田间病圃鉴定法,研究了国内外45个转基因抗虫棉品种(系)的黄萎病抗病性,结果表明,以相对抗性指数(IR)划分抗性类型,抗病品种(系)占6.7％,耐病品种(系)占51.1％,感病品种(系)占42.2％。美国引进品种(系)比国内自育品种(系)的抗病性稍差。棉花黄萎病菌在不同转基因抗虫棉品种(系)上的侵染、扩展规律有较大差异,可分为5类。不同品种(系)的抗病特性不同,可分为3大类。此外,筛选出抗虫棉抗病性鉴定的对照品系—J103。