嘉兰中酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.28)是高等植物体中秋水仙碱合成的关键酶。为了探索嘉兰秋水仙碱生物合成途径的关键酶基因及其相关功能,本研究根据嘉兰转录组数据库和NCBI数据库,克隆得到一个酪氨酸脱羧酶关键酶基因(GsTyDC1)的CDS序列,并使用RT-qPCR检测GsTyDC1在嘉兰植株中不同组织的表达水平。通过烟草悬浮细胞对GsTyDC1进行稳定转化,并分析其亚细胞定位的结果。结果显示,GsTyDC1基因的CDS区全长为1 545 bp,编码514个氨基酸,蛋白分子量为56.3 kD。生物信息学分析表明,GsTyDC1与水仙、石蒜和芭蕉等百合科植物已报道的Ty DC基因聚在一类,具有类似于与其他已报道物种TyDC基因相似的保守结构区域,并且没有跨膜结构和信号肽。此外,GsTyDC1基因在嘉兰根中表达量最高,花和茎次之,在叶中表达量最低。亚细胞定位显示Gs TyDC1蛋白定位在细胞质中。本研究为下一步验证GsTyDC1基因的功能活性提供一定的基础,为阐明GsTyDC1基因在嘉兰秋水仙碱生物合成途径中的作用提供参考依据。     

紫粒小麦高原115中R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4A的克隆及功能分析

花青素在小麦生长发育中参与多种生理生化过程,关于花青素合成机理已被深入研究。本研究利用同源克隆从紫粒小麦高原115中克隆到Ta MYB3-4A基因。Ta MYB3-4A基因组为序列为853 bp,其完整开放阅读框序列为729 bp,含有一个124 bp的内含子;编码蛋白为242个氨基酸,具有典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB蛋白。利用不同的MYB蛋白构建系统发育树,Ta MYB3-4A编码蛋白与调控花青素合成的MYB蛋白聚为一类。Ta MYB3-4A与b HLH基因共同瞬时表达能够诱导白色胚芽鞘中花青素的合成。不同组织特异性表达分析,Ta MYB3-4A基因在高原115胚芽鞘和种皮中表达量高,茎中次之,叶片和颖壳中表达量弱,但在根中并未检测到。研究表明Ta MYB3-4A基因编码蛋白为R2R3-MYB转录因子,调控小麦高原115不同组织中花青素生物合成。     

香蕉BADH基因序列及表达特性分析

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是植物体内甜菜碱合成过程中的关键酶,对植物抵御逆境具有重要作用。为研究香蕉BADH基因序列及表达特性,本研究利用香蕉基因数据库对香蕉BADH基因序列及蛋白序列进行生物学信息分析,采用qTR-PCR技术对香蕉幼苗中BADH基因进行表达分析。结果表明:MaBADH基因属单克隆基因,含有15个外显子,14个内含子;顺式调控元件预测显示在MaBADH启动子区域存在15种激素和逆境胁迫相关的顺式调控元件;蛋白结构域和功能分析有一个甜菜碱醛脱氢酶结构域具有氧化还原酶活性;亚细胞定位在叶绿体中,多重序列比对发现其具有N-端信号肽和C-端信号肽两种信号肽;系统进化树显示其与水稻、玉米、菠萝亲缘关系最近。基因表达分析发现MaBADH具有组织特异表达特性,在叶片中相对表达量最高,假茎次之,根最低;此外,茉莉酸甲酯能够诱导香蕉幼苗根和叶中MaBADH差异表达,其中对叶片的诱导能力更强。本研究为激素信号调控甜菜碱分子保护机制和利用基因工程提高香蕉抗逆性提供了参考依据。     

观赏羽衣甘蓝BoMYB114基因编码区的克隆及序列分析

花青素是羽衣甘蓝叶片呈紫色、红色及粉色的重要色素,R2R3-MYB类蛋白被认为是调控植物花青素生物合成的转录因子。本研究以羽衣甘蓝叶片为试材,采用同源克隆的方法克隆BoMYB114转录因子基因的编码区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:BoMYB114基因编码区长度为753 bp,其包含1个完整的开放阅读框ORF,可编码250个氨基酸,预测蛋白的分子量为28.5 kD,等电点(pI)为9.08。BoMYB114蛋白不存在信号肽,很可能定位在细胞核中。BoMYB114蛋白含有2个MYB保守结构域,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角为主。进化树分析表明,羽衣甘蓝的BoMYB114蛋白与甘蓝型油菜MYB114蛋白序列的一致性最高。羽衣甘蓝BoMYB114基因的克隆与序列特征分析对于进一步研究该基因结构和功能及植物花青素合成代谢途径具有重要意义。     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表达分析

通过对马蓝转录组数据分析,从马蓝叶片cDNA中克隆得到了色氨酸合成酶基因完整的编码序列(CDS),长度为807 bp,命名为BcTSA(GenBank登录号:MG857654),可编码269个氨基酸,并对其蛋白质理化性质、结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、编码蛋白的二、三级结构、亚细胞定位进行了分析。蛋白序列多重比对结果显示与其他植物的TSA蛋白序列具有一定的同源性,并通过qRT-PCR法检测BcTSA基因在不同器官的表达与外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)诱导表达情况。推测其编码的蛋白为亲水蛋白,相对分子质量为28.9 kD,理论等电点(pI)为5.65,无跨膜区;亚细胞定位分析结果显示,BcTSA定位在叶绿体中的可能性大,没有信号肽;有18个磷酸化位点,存在6个潜在的糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋构成;BcTSA氨基酸序列与其它15种物种氨基酸序列的保守区域达到81.35%的相似性;BcTSA基因在马蓝不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,根中最低;另外,发现BcTSA基因响应外源诱导子对代谢的调控。BcTSA基因的克隆与序列分析,有助于研究BcTSA基因的功能,对提高马蓝有效成分的含量具有重要意义。     

甘蔗新基因ShHXT4克隆亚细胞定位及表达特征

以甘蔗品种新台糖22号为材料,利用同源克隆技术从甘蔗中分离出ShHXT4基因,以GADPH基因为内参,并采用实时定量RT-PCR分析该基因在甘蔗组织中的表达,同时构建亚细胞定位载体,通过农杆菌侵染洋葱表皮的方法对ShHXT4编码的蛋白进行亚细胞定位。研究分析发现该基因CDS序列长度为1 632 bp,编码540个氨基酸,蛋白的等电点(p I)为9.16,理论分子量为56.64 k D,命名为ShHXT4,基因编码多肽链中包含信号肽和12次跨膜结构域,且亚细胞定位于质膜,编码一种转运蛋白。洋葱表皮瞬时表达该基因GFP融合载体表明,ShHXT4定位于细胞膜,组织表达分析显示ShHXT4基因在根、茎和叶中均有表达,叶片中的表达量较高,暗示ShHXT4基因可能在甘蔗叶片糖分转运过程中扮演重要角色,研究结果为进一步研究ShHXT4基因的功能及应用提供帮助。     

华丽龙胆花青素合成酶GsANS基因的克隆及其表达分析

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素苷生物合成途径末端的关键酶。本研究以华丽龙胆(Gentiana sino-ornata) 5个不同开放阶段(H₁～H₅)花冠及根、茎、叶为试材,采用RT-PCR技术从花冠H₂阶段分离出了华丽龙胆花青素合成酶基因GsANS的全长序列,利用生物信息学软件分析其序列信息,通过RT-qPCR技术分析表达模式。结果显示GsANS开放阅读框为1 086 bp,编码362个氨基酸,含有PcbC结构域和2OG-FeⅡ-Oxy保守结构域。系统进化分析表明,其与三花龙胆花青素合成酶氨基酸序列相似性高达91.23%,亲缘关系最近。对不同开放阶段花冠及根、茎、叶中GsANS的表达模式进行分析,结果显示GsANS在花冠中表达量均高于根、茎、叶中的表达量,同时在花冠发育的H₄阶段GsANS的相对表达量达到最高值,随后降低,推测Gs ANS基因参与华丽龙胆花冠花青素苷的合成。本研究可为解析华丽龙胆花冠中花青素苷生物合成的分子调控机理提供科学依据。     

秦川牛CDS1基因克隆、分子特征及组织表达分析

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点，以秦川牛为研究对象，利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列，利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征，以GAPDH为内参基因，采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示，秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸，CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性，且与瘤牛的同源性最高；CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白，主要由α-螺旋及不规则卷曲构成；亚细胞定位分析表明，CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体；蛋白互作分析表明，其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用，提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程；组织表达分析表明，CDS1基因在各个组织均有广泛表达，且在睾丸中表达量最高，在脑的表达水平也较高，二者均显著高于其他组织的表达水平，在心的表达量最低。     

‘贵紫麦1号’GzA BI5-3A3基因的克隆及在烟草中的功能分析

ABI5在植物种子休眠与萌发、生长发育、花青素合成以及对逆境胁迫的响应等诸多生物学过程中起着重要作用。而大量研究表明ABI5参与种子休眠与萌发,少有研究表明ABI5参与花青素合成。为了探究ABI5转录因子参与调控小麦花青素合成,本研究从‘贵紫麦1号’中扩增得到Gz ABI5-3A3的c DNA全长。其启动子顺式元件分析结果表明Gz ABI5-3A3可能参与调控植物生长、光合作用、开花及种子萌发和花青素累积的生物学过程。蛋白质系统进化树分析表明,Gz ABI5-3A3与小麦中Ta ABI5D-SH-31、Ta ABI5D-SH-23和Ta ABI5D-SW-23同源。本研究进一步构建Gz ABI5-3A3基因的过表达载体PBI121-Gz ABI5-3A3,用于烟草遗传转化,共获得8个烟草转基因株系。本研究对Gz ABI5-3A3过表达转基因株系进行研究发现,转基因烟草株系L4、L7和L15苗期叶片中花青素含量显著低于野生型,其花青素合成途径的结构基因Nt PAL、Nt DFR、Nt ANS和Nt CHS的表达量显著下降。研究结果表明Gz ABI5-3A3能够通过调控花青素合成途径结构基因的表达来负向调控植物花青素的合成,为后续研究Gz ABI5-3A3调控花青素合成的分子机制提供研究基础。     

紫薇LiANS基因的克隆和表达及与花青素含量的关系

花青素合成酶(anthocyanidin synthase, ANS)是植物花青素生物合成途径末端的限速酶。为初步探究Li ANS在紫薇花青素生物合成途径上的功能,本研究以紫薇‘紫韵’为试材,利用RACE技术获得ANS基因的全长,并进行生物信息学的分析和原核表达。采用qRT-PCR与LC-MS技术检测LiANS基因在叶片不同发育时期的表达情况并与花青素含量做相关性分析。结果显示,LiANS的cDNA序列全长1 378 bp (基因登录号为MT023557),开放阅读框为1 068 bp,编码355个氨基酸,蛋白分子量为40.221 91 kD,理论等电点5.34,具有典型的2OG-FeII-Oxy保守结构域,是不稳定亲水性蛋白。系统进化树分析表明LiANS与石榴的亲缘关系最近。构建原核表达pCold-Li ANS载体,在IPTG诱导下获得了LiANS融合表达蛋白,与预期分子量一致。荧光定量PCR与LC-MS分析表明LiANS基因在红色的嫩叶时期表达量最高,随着叶片成熟转为绿色和灰紫色而不断下降。相关关系矩阵表明LiANS基因表达量与花青素含量相关性系数为0.854 508,推测LiANS基因参与了花青素的积累。为深入研究LiANS基因功能在紫薇花青素生物合成的分子调控网络提供科学依据。     

苦荞FtERF基因克隆、生物信息学及其表达分析

乙烯响应因子对植物发育和细胞代谢具有重要作用。通过RT-PCR从苦荞中克隆出ERF基因,对其进行生物信息学分析和差异表达分析。结果表明,FtERF基因开放阅读框长度为729 bp,编码了243个氨基酸,编码的蛋白分子量26.08 k D,等电点9.22,属于亲水性蛋白。FtERF不含有信号肽和跨膜螺旋结构,亚细胞定位在细胞核内,蛋白质二级结构和三级结构高度相似。FtERF含有抑制基序DLNxxP,系统进化表明FtERF和ERF4关系较近。经荧光定量表达发现,厚壳苦荞不同部位表达均高于薄壳苦荞,苦荞发育成熟期表达高于非成熟期。     

水稻逆境响应蛋白OsSGL的生物信息学分析及原核表达条件优化

水稻OsSGL (Oryza sativa stress tolerance and grain length)基因表达响应多种非生物逆境,参与调控水稻产量及耐旱性。该基因CDS全长768 bp,编码一个包含DUF1645 (Domain of unknown function protein family 1645)结构域的功能蛋白。生物信息学分析预测显示该蛋白分子量为26.73 kD,理论等电点为9.35,为亲水性蛋白且没有跨膜区域,蛋白二级结构中α螺旋占15.69%,β转角占3.14%,延伸链占14.51%,无规则卷曲占66.67%。OsSGL基因CDS序列中稀有密码子的比例高达29.69%,且有多个串联稀有密码子。为进一步在生化水平研究OsSGL蛋白,本研究拟在原核表达系统中大量表达、纯化并鉴定His标签融合表达的OsSGL蛋白。在不改变氨基酸序列的前提下,通过全基因合成技术,根据大肠杆菌密码子偏好性对OsSGL CDS序列进行优化、合成并连接到pET-32a表达载体中;然后将重组质粒pET-32a-OsSGL转化大肠杆菌,经体外表达条件优化大量合成融合His标签表达的OsSGL蛋白。结果显示,OsSGL基因在大肠杆菌中可实现诱导表达,融合蛋白分子质量约为45.7 kD。最优诱导表达温度、时间、IPTG浓度和摇床转速分别为16℃、16 h、0.5 mmol/L和120 r/min。利用His抗体进行Western blotting进一步检测到纯化的His-OsSGL融合蛋白。OsSGL蛋白体外表达体系的建立有利于在生化水平上深入解析OsSGL参与的信号调控通路。     

百脉根ACC氧化酶基因LcACO1的克隆及序列分析

植物激素乙烯参与植物生长发育多个生理过程的调控。ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键合成酶。本研究依据其它物种ACC氧化酶序列信息设计简并引物,并结合RT-PCR和快速扩增c DNA末端技术从牧草百脉根中首次克隆到ACC氧化酶基因的全长c DNA序列,命名为LcACO1。LcACO1全长c DNA为1 012 bp,具有一个924 bp ORF可编码307个氨基酸残基。生物信息学分析表明,LcACO1是含有Fe2+依赖的加氧酶结构域的稳定亲水蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与其它植物中的ACO蛋白进行同源性比对显示,LcACO1蛋白与鹰嘴豆中ACO蛋白的一致性高达90%。实时荧光定量PCR表明,LcACO1基因在百脉根不同组织器官中差异表达,根中表达量最高,推测其主要在根的生长发育调节方面发挥作用。     

苦荞14-3-3基因家族生物信息学分析

14-3-3蛋白是普遍存在于真核细胞中的蛋白质,在植物的生长发育、信号传导、抵御胁迫等方面发挥着重要的作用,编码14-3-3蛋白的基因以基因家族的形式存在。本试验利用BLASTp从苦荞全基因组中查找到19个14-3-3基因家族成员,其编码蛋白中ε类蛋白序列8条,非ε类蛋白序列11条。利用生物信息学软件对14-3-3蛋白的氨基酸序列进行理化性质分析,发现它们的长度介于101～242 aa,等电点范围为4.27～9.59,大部分表现为酸性亲水蛋白,通过亚细胞定位预测其存在于细胞质、叶绿体、胞外、细胞核和细胞骨架中。通过对苦荞14-3-3蛋白的结构分析,发现该蛋白以α-螺旋、延伸链、无规则卷曲为主来维持蛋白质结构的相对稳定性且蛋白质序列高度保守,共含有8个保守基序,分布在7条染色体上。根据苦荞14-3-3蛋白的理化性质、结构、进化等方面的分析对其功能进行了初步的预测,推测苦荞14-3-3蛋白在靶蛋白亚细胞定位、基因转录、物质跨膜运输、非生物胁迫、代谢调控中发挥着重要的作用。本研究为后续苦荞14-3-3蛋白复杂结构和生物学功能等方面的深入研究提供科学依据。     

白芨蔗糖转运蛋白基因BsSUT2的克隆和表达分析

蔗糖转运蛋白(SUTs)在介导蔗糖由源到库器官的长距离运输、植物生长发育以及抵抗逆境胁迫中发挥重要作用,研究白芨蔗糖转运蛋白BsSUT2的序列信息与表达模式,为揭示其蛋白结构及基因功能提供依据。基于白芨转录组数据,采用RT-PCR技术获得白芨Bs SUT2基因CDS全长,通过生物信息学软件分析Bs SUT2编码蛋白的分子特征,并对BsSUT2进行氨基酸序列比对与系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR技术检测BsSUT2基因的组织表达模式。结果表明,克隆获得的BsSUT2基因CDS全长为1 584 bp,编码527个氨基酸。BsSUT2蛋白包含12个跨膜结构域,亚细胞定位预测表明BsSUT2蛋白定位于质膜,与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰SUT2基因编码蛋白序列一致性高,隶属于SUT4亚族。Bs SUT2基因的表达具有组织特异性,其转录本在白芨幼苗的假鳞茎中表达量最高。推测BsSUT2基因在白芨生长发育和蔗糖的分配中发挥重要作用。本研究对白芨BsSUT2基因的序列特征与组织表达模式进行分析,为阐明Bs SUT2基因在蔗糖运输与分配、生长发育和逆境胁迫中的功能提供实验数据支持。     

梭梭HaNAC2基因克隆、表达分析及亚细胞定位

本研究从梭梭中克隆得到1个NAC转录因子,命名为HaNAC2。同源性比对分析结果显示该基因含有典型的NAC蛋白结构域。系统发育分析结果推测该蛋白属于NAC家族第Ⅰ组的SENU5亚家族,组织特异性分析结果表明该基因在梭梭同化枝中表达量最高,荧光定量PCR结果显示该基因的表达量随干旱胁迫时间的增加而升高,推测其表达受干旱胁迫诱导。本研究克隆了该基因的启动子并进行分析,结果发现HaNAC2基因的启动子含有启动子固有元件,如TATA-box,CAAT-box等,还含有一些调控元件如MYB结合位点、组织特异性表达响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列。通过PEG介导的原生质体转化法进行亚细胞定位分析,结果显示该蛋白定位于细胞核。本研究初步探索了HaNAC2基因的表达及定位,为进一步研究该基因在梭梭抗旱中的功能打下基础。     

玄参不同颜色子芽比较转录组学分析

为了比较玄参不同颜色子芽中花青素苷生物合成相关基因的表达模式,推测控制玄参子芽颜色差异的主要原因,本研究以玄参不同颜色子芽为试验材料,采用Illumina HiSeq^TM4000技术对其进行转录组测序,将获得的数据进行功能注释以及生物信息学分析,并对花青素苷生物合成相关基因在不同颜色子芽中的差异表达进行了比较分析。通过测序,共得到170 552条Unigenes,其中9 900条Unigenes在NT、NR、KOG、GO、Swiss Prot、KO和pfam数据库中均得到了注释;且KEGG分析表明,有364条Unigenes参与苯丙素生物合成,有63条Unigenes参与类黄酮生物合成,有21条Unigenes参与花青素苷生物合成。进一步对不同颜色子芽中花青素苷生物合成基因进行了比较分析,发现紫芽、绿芽中编码CHS、CHI、F3H、DFR、3GT和OMT等酶类基因的表达量均高于白芽。本研究初步揭示了花青素苷合成基因在不同颜色玄参子芽中的差异表达,为后期玄参子芽抗逆性研究和质量分级提供了理论依据。     

湖羊myogenin重组基因表达及其亚细胞定位的研究

摘 要： [目的]构建湖羊肌细胞生成素（myogenin,MyoG）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白真核表达载体,分析EGFP-MyoG融合蛋白在NIH-3T3细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增出MyoG基因完整的CDS,克隆至真核表达载体pEGFP-C1,转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜下观察EGFP-MyoG融合蛋白的亚细胞定位,并通过RT-PCR、western blot检测蛋白的表达。[结果]酶切鉴定和DNA序列分析均证实,MyoG基因已正确插入pEGFP-C1中,获得融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,转染NIH-3T3细胞48h后,RT-PCR检测到约680bp的特异性条带,western blot检测出相对分子量约为53kD的融合蛋白,荧光显微镜分析表明,MyoG蛋白定位于细胞核。[结论]融合蛋白EGFP-MyoG在NIH-3T3细胞中成功表达,并定位于细胞核。     

水稻DUF966基因家族的生物信息学分析

DUF966基因家族是一类未知功能的基因家族,它们在水稻生长发育和逆境胁迫应答反应中可能起重要作用,为了研究这些基因的生物学功能,初步揭示它们对水稻生长发育和抗逆性的调控作用,本研究通过生物信息学方法,分析了水稻DUF966家族基因特征、系统进化、芯片表达谱、跨膜结构域、信号肽以及亚细胞定位。结果表明,水稻DUF966基因家族包含7个成员,几乎都具有转录活性,它们编码的蛋白质只包含1~2个保守的未知功能结构域(DUF966结构域);进化分析表明,该家族可分为4个亚群,其中Os DSR2、Os DSR4、Os DSR5和Os DSR6同属一个亚群,可能具有相似的生物学功能;芯片表达谱分析表明,该家族基因主要在幼苗、花序和茎中呈中、低度表达,Os DSR3和Os DSR7基因受盐和低温胁迫的诱导表达,其它基因受不同非生物胁迫的抑制表达,该家族多数基因还能被白叶枯病菌侵染诱导表达;蛋白预测表明,该家族蛋白不含跨膜结构域和信号肽序列,能够被定位在细胞质中。本研究为系统开展水稻DUF966基因家族的生物学功能研究提供了依据。     

牦牛CTGF基因克隆、蛋白功能及组织表达分析

为获得牦牛CTGF基因的CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,并研究该基因在肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌等组织中的mRNA表达水平.以类乌齐牦牛为研究对象,采取RT-PCR方法获得类乌齐牦牛CTGF基因CDS序列,荧光定量PCR(qPCR)方法检测该基因在其5个组织中的mRNA表达水平.结果显示:牦牛CTGF基因含2个CpG岛,开放阅读框长度为1050 bp(登录号:MT968972),可编码349个氨基酸,CTGF编码蛋白存在信号肽,为水溶性不稳定的表面蛋白,共存在21个磷酸化位点和7个糖基化位点,在内质网和微体(过氧物酶体)中分布较多,有3个完整的保守功能结构域.荧光定量结果显示,CTGF基因在类乌齐牦牛肾脏、心脏、肺脏、肝脏和臀肌组织中均有表达,且在肝脏中表达水平最高.旨在为CTGF基因在调控牦牛肌肉生长发育方面提供参考数据.