药用植物内生真菌的分离及拮抗菌的筛选与鉴定

为更好地研究药用植物内生拮抗菌种,以6种药用植物(连钱草、小白酒草、毛茛、土三七、唐松草、白屈菜)作为植物材料进行菌种提取分离,并检测其抑菌活性.选择其中3种抑菌活性较高菌株通过18S rDNA序列测定,构建系统发育树,进行分子生物学鉴定.结果 表明,6种药用植物均含有多种内生真菌,连钱草分离得到5株内生真菌,小白酒草...     

栽培三七内生真菌优势种群分离鉴定

栽培三七为五加科人参属多年生草本药用植物,旨在从药用植物栽培三七中分离出能够产生与宿主植株相同或者相似的生物活性物质的内生真菌菌株。以栽培三七为材料,开展栽培三七内生真菌的分离、纯化,依据传统形态特征并结合真菌的ITS序列进行菌株鉴定。初步从栽培三七中共分离得到内生真菌24株,鉴定为12属（种）,栽培三七不同器官组织的内生真菌种类和数量差异较大,根和叶中最多,茎中较少。其中从叶片中分离出11株,6属;茎中分离出1株,1属;根中12株,5属。统计结果表明叶片中分离出的菌株优势种为普通青霉菌(Penicillium commune)、胶孢刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides),均占叶片菌株分离的27.28%;须根中分离出的菌株优势种为球毛壳菌(Chaetomidium arxii),占须根菌株分离的72.73%。栽培三七内生真菌具有丰富的生物多样性,实验结果为进一步探讨栽培三七内生真菌与生理活性物质之间的关系提供材料基础和实验参数。     

内生真菌发酵对刺五加异嗪皮啶合成的影响

采用内生真菌发酵刺五加以提高其活性成分异嗪皮啶的含量,并对其进行分离纯化。分别选取4株内生真菌对刺五加进行发酵,以异嗪皮啶为对照,采用HPLC法分析发酵样品中异嗪皮啶的含量变化,确定能够定向提高发酵样品中异嗪皮啶含量的目的菌株;采用硅胶柱色谱法分离纯化发酵样品中的异嗪皮啶;采用形态学观察和ITS rDNA序列同源性分析对目的菌株进行种属鉴定。结果表明,内生真菌AJ14能显著提高刺五加发酵样品中异嗪皮啶成分含量。采用硅胶柱色谱法从刺五加发酵样品中分离到异嗪皮啶;经鉴定,目的菌株AJ14为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)。采用内生真菌发酵刺五加可定向提高异嗪皮啶的含量,研究结果可为微生物发酵法生产异嗪皮啶提供参考。     

蒲公英内生真菌分离纯化及其形态学鉴定

蒲公英是一种传统的植物同源医药和食品,具有良好的抗菌和消炎作用。蒲公英提取物含有各种具有抗菌活性的化合物,而内生真菌产生相同或相似的代谢物作为宿主植物,它可以打开抗菌化合物的开发和利用新的方式。药用植物蒲公英可以培养多种内生真菌。因此,以新鲜根、茎和叶,无昆虫的蒲公英为材料,对其内生真菌及形态学等方面进行了初步研究。结果表明,运用组织切块法,从蒲公英的植物组织中分离出14种内生真菌;采用平板划线法分离纯化蒲公英根、茎、叶培养的内生真菌;观察、分离和纯化内生真菌的形态学鉴定。     

濒危药用植物沙冬青内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

为探明濒危药用植物沙冬青内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行了分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果显示,从沙冬青不同组织器官中分离出41株内生真菌,根部最多,其次为叶部,茎部最少,经形态学初步分类鉴定归于5个目,6个科,19个属;有31株菌对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的75.6%,15株内生真菌对1种或多种供试细菌指示菌具有不同程度的抑制作用,占分离菌株总数的36.6%,其中5株内生真菌分别对4种植物病原真菌指示菌具有明显的抑制作用,占菌株总数的12.2%,8株内生真菌对1种供试细菌指示菌有明显的抑制作用,占分离菌株总数的19.5%, 4株内生真菌菌株即对供试植物病原真菌指示菌又对供试细菌指示菌有明显抑制作用, 抑菌范围宽,属于青霉属、束丝菌属、茎叶核菌属。濒危药用植物沙冬青具有丰富的内生真菌资源,其开发和利用具有重要的生态学意义和经济价值。     

产生物碱的甘肃贝母内生真菌的筛选、鉴定及抑菌活性测定

为了探索甘肃贝母(Fritillaria przewalskii Maxim.)内生真菌的应用价值,以甘肃贝母为材料,研究其内生真菌生物碱类代谢产物的多样性及抑菌活性。利用生物碱沉淀反应和薄层色谱技术(thinlayer chromatograph TLC)检测生物碱类成分,依据平板打孔法测定其抑菌活性,结合形态特征和内转录间隔区(internal transcribed spacer ITS)序列鉴定菌株。从甘肃贝母的健康鳞茎中分离得到13株内生真菌,其中,菌株G6能产生多种生物碱物质。但薄层色谱分析表明,菌株G6代谢的生物碱成分与川贝类生物碱并不一致。测定其抑菌活性发现,总生物碱提取液对金黄色葡萄球菌有显著的抑制效果而对粪肠球菌的抑制作用中等。结合形态学特征及ITS序列信息,菌株G6被鉴定为镰刀菌属接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)。虽然菌株G6并不能产生与寄主相同的生物碱物质,但其在新生物碱及抑菌化合物的开发利用方面具有一定的价值。     

罗汉松和珙桐内生真菌的分离及其多样性研究

为了深刻认识罗汉松和珙桐内生真菌的多样性,分离了183株罗汉松和珙桐内生真菌,结合形态学和分子分类方法对分离内生真菌进行种属鉴定;采用限制性片段长度多态性(RFLP)方法研究分离菌株的遗传多样性。结果表明96株罗汉松内生真菌鉴定为曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、拟茎点霉属Phomopsis、丝枝霉属Aphanocladium、脉孢菌属Neurospora和无孢菌群,Shannon多样性指数为1.73;87株珙桐内生真菌分属于曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、拟茎点霉属Phomopsis、青霉属Penicillium、炭角菌属Xylaria sp.和无孢菌群,Shannon多样性指数为1.53。采用RFLP方法,对全部内生真菌rRNA基因间隔区(ITS)的核苷酸多样性进行了分析,罗汉松和珙桐内生真菌分别聚为22个分枝,同属的菌株聚在一起,同属菌株的RFLP分类相似性在93%以上。罗汉松和珙桐内生真菌中都有无孢菌群,部分菌株与鉴定菌株同处一个分枝中,其他相距较远的无孢菌可能为新的种属。本研究结果提示,罗汉松和珙桐内生真菌的多样性丰富。     

盐碱地引种沙枣根瘤内生菌及根际土壤AM真菌的多样性

为了揭示黑龙江省盐碱地引种沙枣根瘤内生菌及根际土壤丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal,AM)真菌的多样性,采用根瘤切片法和湿筛法并结合分子生物学手段对沙枣根瘤内生菌及根际土壤中的AM真菌进行分离、鉴定和多样性分析。研究结果表明:从沙枣根瘤内成功地分离和鉴定出了27个纯菌株,其中放线菌4株、细菌14株、真菌9株,内生细菌的多样性指数最为丰富,与根瘤形成有关的内生放线菌多样性指数最低,但放线菌类群中Frankia sp.(代号H01)菌株优势度指数和均匀度指数最高;从沙枣根际土壤中共分离和鉴定出5属8株AM真菌,Glomus属有3株,Funneliformis属有2株,Septoglomus属有1株,Rhizophagus属有1株,Acaulospora属有1株。Rhizophagus intraradices在样品中的分离频度达到了100%,孢子密度高达48.5个/50 g土,是典型的优势菌株。在沙枣苗木菌根化及根瘤化培育过程中,Frankia sp.(H01)和Rhizophagus intraradices可作为重要的候选菌株。     

筒鞘蛇菰内生真菌的分离及拮抗菌筛选

为了考察筒鞘蛇菰（Balanophora harlandii Hook. f.）内生真菌的类群组成,寻找高活性的抗菌物质,用组织块分离法和杯碟法筛选出能产生高抑菌活性的蛇菰内生真菌菌株。从神农架野生筒鞘蛇菰不同组织内共分离、纯化得到49株内生真菌,对其中生长良好的28株内生真菌归属于半知菌亚门丝孢纲的2目2科7个属,分别是丝核菌属（Rhizoctonia）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、地霉属（Geotrichum）、小孢霉属（Microsporum）、从梗孢属（Monilia）和粉孢属(Oidium)。这28株内生真菌对于3种供试靶标细菌表现不同的抑菌活性,其中SG47菌株的抑菌作用较强。这些内生真菌能够产生丰富的抑菌活性物质,极具从中寻找新型杀菌剂或药物先导化合物的潜力。     

大兴安岭北方森林凋落物真菌及其抗菌化合物

为了研究大兴安岭森林凋落物真菌的抗菌活性,首先利用颗粒涂布平板法分离真菌,通过扩增与比对内部转录间隔区序列初步鉴定分离到的真菌。采用双平板打孔药剂扩散法检测抗菌活性,使用层析法分离目标菌株单体化合物。通过波谱学分析确定其化学结构,使用96孔板液体稀释法检测单体化合物的最低抑菌浓度。共分离得到88株真菌,其隶属于57个属、74个分类单元,其中18株真菌内部转录间隔区序列相似性≤97%。其中6株真菌的乙酸乙酯提取物具有抗菌活性,2株真菌KNFL008和KNFL040抗菌活性较强。经活性追踪分离,共得到4个单体化合物,分别为化合物A（1,3-2-羟基-5-十五烷基苯）、化合物B（麦角固醇）、化合物C（2-氨基-3H-苯氧嗪-3-酮）和化合物D（2-乙酰氨基-3H-苯氧嗪-3-酮）。对化合物A、B、C进行了最低抑菌浓度的测定,为3.13~200 μg/mL。化合物A和D为首次在真菌提取物中分离。本研究为进一步开发利用大兴安岭凋落物真菌资源打下了基础。     

不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较

摘 要：【研究目的】表面消毒是植物内生菌分离的关键步骤之一,不同的表面消毒方法不仅会影响表面消毒效果,对内生菌的分离效果也有一定影响。本文分析比较了几种不同的表面消毒方法下分离获得的内生菌数量及种类。【方法】采用传统的分离方法,即真菌用组织块法,细菌用稀释梯度法进行分离。【结果】结果表明无论是内生真菌还是内生细菌二氧化氯方法处理下获得的内生菌种类最多。即二氧化氯法获真菌6株,鉴定为5个属,细菌37株,鉴定为11个属种（其中包括1个放线菌属）;次氯酸钠法获真菌8株,鉴定为3个属,细菌4株,鉴定为3个属种;升汞法获真菌3株,鉴定为3个属,细菌1株,为未知种。从分离内生菌的数量上比较,二氧化氯方法分离获得的细菌数显著性的多于其他两种方法,由多到少依次为二氧化氯法、次氯酸钠法、升汞法。【结论】二氧化氯表面消毒更适合进行内生菌多样性研究,但不同的表面消毒方法会获得不同的机会菌株。     

广灵苦荞黄酮类化合物的分离和鉴定

[目的]研究山西特有品种广灵苦荞黄酮类化合物的类别。[方法]采用大孔吸附树脂法、柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶色谱法结合HPLC进行分离纯化,通过质谱分析和核磁共振分析鉴定黄酮的化学结构。[结果]从广灵苦荞中分离得到7个黄酮化合物,分别为芦丁(1),表儿茶素(2),异槲皮素(3),槲皮素-3-O-鼠李糖苷(4),槲皮素(5),山奈酚(6)和金丝桃苷(7)。结论:化合物2-5和7为首次从广灵苦荞中分离。     

甘草产香内生真菌RP2的初步鉴定及挥发性成分分析

为了开发甘草内生真菌RP2次生代谢产物的资源,丰富挥发性香味成分的获取途径,以甘草内生真菌RP2为研究对象,采用形态学观察及ITS序列分析法对其进行菌种鉴定,通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对甘草内生真菌RP2挥发性成分进行分析。甘草内生真菌RP2经鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。在甘草内生真菌RP2发酵液中分离并鉴定出11种挥发性成分;在甘草内生真菌RP2菌丝体中分离并鉴定了6种挥发性成分。甘草内生真菌RP2挥发性成分中含有多种现有工业生产中广泛应用的挥发性香味成分,如2-苯基乙醇等。本研究对开发利用甘草内生真菌RP2具有重要意义。     

艾纳香内生真菌抗细菌和炭疽菌的活性研究

为获得丰富的艾纳香内生真菌资源,筛选出抗性生防菌株,用于活性次生代谢产物的发现,通过水琼脂法对海南产艾纳香进行内生真菌分离,通过ITS序列分析,对其进行鉴定和分析。采用滤纸片法评价内生真菌发酵产物对细菌的抑制活性,采用平板对峙培养法评价艾纳香内生真菌对植物炭疽菌的拮抗作用。本研究共分离鉴定出191株内生真菌,分属于27属,45种,其中优势菌属为Diaporthe、Paraphoma、Ectophoma、Penicillium、Talaromyces、Hypoxylon、Phomopsis、Colletotrichum和Fusarium。抗细菌活性结果显示,Clonostachys、Fusarium和Diapothe属活性较强。抗炭疽病菌试验显示,Talaromyces、Ectophoma和Penicillium属活性较强。本研究初步探讨了海南产艾纳香内生真菌种类的多样性,并首次对其进行了抗病原菌活性筛查,获得的活性菌株可作为微生物源菌剂开发的重要材料。     

凋落物真菌Berkleasmium sp.及其螺二萘类化合物抗菌活性的研究

为了分离鉴定森林凋落物中可培养的真菌,并发现具有抗菌活性的菌株,研究它们的主要抗菌代谢物,为进一步开发利用凋落物真菌资源提供备选菌株。本研究通过颗粒法分离森林凋落物中的可培养真菌,用内部转录间隔区(ITS)序列分析鉴定分离到的真菌,采用打孔药剂扩散法检测抗菌活性,利用柱层析法分离抗菌单体化合物,通过波谱学分析确定其化学结构。共分离得到63株真菌,它们隶属于36个属、48个分类单元,它们中有14株菌ITS相似性小于98.5%。通过抗菌活性筛选发现,11株真菌的乙酸乙酯提取物具有抗菌活性,其中Berkleasmium sp. SGSF622抗菌活性较强。通过PDA培养基对该株真菌进行发酵,获得乙酸乙酯提取物3 g。通过抗菌活性追踪分离,得到其含量最高的抗菌化合物622A。通过核磁共振及高分辨质谱分析,进一步确认该化合物为螺二萘类化合物Sch53825,它的分子式为C₂₀H₁₃ClO₅.,其抗青枯劳尔氏菌的最低抑菌浓度为125～250μg/mL。研究首次在Berkleasmium属真菌中分离到化合物Sch53825,并首次发现...     

产紫丁香苷内生真菌CJ7的鉴定及发酵条件研究

为高效利用刺五加内生真菌资源,推动紫丁香苷的生产,采用HPLC法,以紫丁香苷为对照,分析内生真菌CJ7的次生代谢产物;采用琼脂糖扩散法,对内生真菌CJ7进行抑菌活性分析,并采用单因素实验及正交实验法对内生真菌CJ7发酵条件进行优选;采用形态学观察及ITS序列分析法对内生真菌CJ7进行菌种鉴定。结果表明,在内生真菌CJ7发酵液中含有紫丁香苷。抑菌活性实验结果表明,内生真菌CJ7对10种致病菌均有较好的抑制作用,尤其对金黄色葡萄球菌抑菌效果较为明显。经优化,CJ7的最佳发酵工艺为培养基中葡萄糖质量浓度2.5%,牛肉膏质量浓度2.0%,初始pH 7.0,装液量40%,接种量2%,培养8天,摇床转数120 r/min,发酵温度28℃。经鉴定,内生真菌CJ7为产烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。上述研究说明,内生真菌CJ7为紫丁香苷产生菌。研究结果可为采用微生物发酵法生产紫丁香苷提供参考。     

山东省不同地区棉花内生真菌的多样性和群落结构分析

【目的】内生真菌能够促进植物生长,提高植物抵御外界不良环境的能力。本文旨在对棉花内生真菌的群落结构和多样性进行系统分析,明确内生真菌资源分布,同时探讨生长环境与内生真菌群落结构和多样性的关系。【方法】在山东省19个地区采集棉花叶片,运用马铃薯葡萄糖(Potato dextrose agar)培养基进行内生真菌的分离、纯化、保存,采用内转录间隔区(Internal transcribed spacer)序列分析技术进行种属鉴定,并对分离得到的内生真菌进行群落结构和生物多样性分析。【结果】19个地区的棉花取样中,共分离得到134个菌株归属于15个属(包括Alternaria、Fusarium、Diaporthe、Penicillium、Stemphylium、Bipolaris、Epicoccum、Curvularia、Nigrospora、Botryosphaeria、Lichtheimia、Gibellulopsis、Phaeosphaeria、Cladosporium、Setosphaeria)。依据相对分离率,山东省的棉花内生真菌优势属为Alternaria(77.12%)。具体分析,滨州市滨城区和桓台的优势属为Fusarium(66.67%、100.00%),曹县的优势属为Alternaria (50.00%)、Fusarium(50.00%),济阳的优势属为Alternaria(37.50%)和Setosphaeria(37.50%)。不同地区内生真菌定植率差异显著,其中最高的是垦利(85%),其次为茌平(70%)、无棣(60%),而惠民、邹城的最低(5%)。根据Shannon-Weaver指数,济阳棉花内生真菌生物多样性最高(1.26),其后依次为茌平(1.15)、滨州市滨城区(0.87)、曹县(0.69)、郓城(0.64)、无棣(0.59)、垦利(0.57)、金乡(0.51)、商河(0.35),成武、东阿、高唐、惠民、聊城市东昌府区、夏津、阳谷、鱼台、邹城、桓台仅鉴定出1种棉花内生真菌,生物多样性最低。19个地区内生真菌聚成2个类群,一类是茌平、无棣、垦利,此类内生真菌定植率高,鉴定出的菌属数目多,其他地区聚为一类,内生真菌种类少,定植率低。【结论】山东省棉花内生真菌具有丰富的多样性。地域对内生真菌的分布具有一定的影响。     

大兴安岭森林凋落物真菌及其次生代谢物活性研究

研究旨在得到大兴安岭森林凋落物中具有活性的新型真菌资源。用颗粒法分离森林凋落物中的可培养真菌。用真菌的内部转录间隔区序列对分离到的真菌进行分子生物学鉴定。两种方法被用来对新型真菌进行发酵与次生代谢物粗提物的制备。通过双层平板药剂扩散法与薄层层析清除DPPH自由基法分别测试粗提物的活性。分子鉴定结果表明分离培养了40株凋落物真菌,它们隶属于35个属,38个分类单元,其中6株真菌为疑似真菌新种。来自2株真菌的2个提取物展现了抗细菌活性。尤其是Parapyenchaeta属新种LB0026号菌株具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性,对供试革兰氏阴性细菌未展现明显活性。另外还有2株真菌的2个提取物展现了清除DPPH自由基活性。这2个提取物分别含有2个和3个抗氧化化合物。大兴安岭森林凋落物中,可培养真菌种类丰富,其中有4株新型真菌具有明显的抗菌活性或抗氧化活性,值得深入研究。     

大兴安岭森林凋落物真菌及其次生代谢物活性

【目的】研究旨在得到大兴安岭林下凋落物中具有活性的新型真菌资源。【方法】利用颗粒法分离森林凋落物中的可培养真菌进行。利用真菌的内部转录间隔区序列对分离到的真菌进行分子生物学鉴定。利用两种方法进行对新颖的真菌进行发酵与次生代谢物粗提物的制备。通过双层平板药剂扩散法与薄层层析清除DPPH自由基法分别测试粗提物的活性。【结果】分子鉴定结果表明分离培养了40株凋落物真菌,它们隶属于35个属,38个分类单元,其中6株真菌为疑似真菌新种。来自2株真菌的2个提取物展现了抗细菌活性。尤其是Parapyenchaeta属新种LB0026号菌株具有较强的抗革兰氏阳性细菌活性,对供试革兰氏阴性细菌未展现明显活性。另外还有2株真菌的2个提取物展现了清除DPPH自由基活性。这两个提取物分别含有2个和3个抗氧化化合物。【结论】大兴安岭林下凋落物中,可培养真菌种类丰富,其中有四株新型真菌具有明显的抗菌活性或抗氧化活性,值得深入研究。     

人参灰霉病菌拮抗细菌菌株筛选及鉴定

从林下参叶片中分离内生细菌,以人参灰霉病菌为指示菌,筛选拮抗菌株,基于形态学特征和16S rRNA基因序列分析,对拮抗菌株进行鉴定。结果表明,从林下参叶片中共分离得到56株内生细菌,其中菌株FS-1对人参灰霉病菌具有很好的抑制作用。采用生长速率法测定菌株FS-1的发酵液对8种植物病原真菌均有抑制作用。该菌株具有很好的固氮作用,且能够分泌吲哚-3-乙酸(IAA)和产生胞外蛋白酶,IAA产量为4.25 mg/L。通过形态特征观察、生理生化测定和16S rRNA序列分析结果,将菌株FS-1鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。本研究表明菌株FS-1具有一定的生防潜力,可用于人参灰霉病的生物防治。