橡胶树品种‘湛试327-13’乙烯响应分子机制分析

橡胶树‘湛试327-13’新品种兼具抗寒和高产的特性,揭示其在乙烯刺激后的分子机制有利于精准鉴定和选育种质资源。本研究以1.5%乙烯利处理橡胶树‘湛试327-13’开割树为材料,利用荧光定量技术分析胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白和橡胶生物合成关键酶等基因的表达规律,结果表明：乙烯利处理并连续割6刀后,橡胶树活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因在树皮表达量高于其在胶乳中表达量。与对照相比,随着割胶刀数的增加,‘湛试327-13’树皮脂肪氧化酶(HbLOX1)和过氧化物酶基因(HbPOD1)基因表达显著上调,最高为22.15和31.95倍;蔗糖转运蛋白HbSUT1、HbSUT2a分别提高66.11和58.50倍;几丁质酶(HbCHI)、葡聚糖酶(HbGLU)和橡胶素(HbHEV)分别提高16.93、8.09和10.37倍;橡胶生物合成关键酶基因HbGGPPS和HbHMGS1分别提高了14.71和15.05倍。说明乙烯刺激橡胶树后,‘湛试327-13’胶乳和树皮中活性氧淬灭酶、蔗糖转运蛋白、胶乳抗性和橡胶生物合成关键酶基因依次高表达且持续时间长达6刀(18 d...     

树干乙烯利处理对橡胶树叶片蔗糖代谢的影响

为增加天然橡胶产量,乙烯利被广泛使用。乙烯利刺激橡胶树能通过延长排胶时间,促进水孔蛋白的表达,增加蔗糖向乳管中转运等机制促进橡胶树树干中胶乳的生物合成。然而,乙烯利刺激树干,是否会对叶片造成影响,影响胶乳的合成,目前仍不清楚。本研究以热研8-79和热研72059一年生芽接苗为实验材料,用浓度为0%、0.6%和1.1%的乙烯利处理树干,检测叶片生理指标的变化。实验结果表明:热研8-79施用乙烯利后,胶乳产量增加,同时,叶片中叶绿素含量降低,蔗糖含量也显著降低,而果糖和葡萄糖含量升高,蔗糖合成酶活性上升,液泡转化酶和蔗糖分解合成酶活性增高。热研72059与热研8-79的结果类似,但蔗糖磷酸活性酶显著性升高,且蔗糖含量,蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性远高于热研8-79品种。研究结果表明,乙烯利刺激树干后,能改变叶片中蔗糖的代谢活动,这可能也是增加胶乳产量的机制之一。本研究以叶片为研究对象,为从源-库关系解析乙烯利刺激促进天然橡胶合成机制提供技术理论基础。     

巴西橡胶树雄性不育相关基因HbACO1的表达与生物信息学分析

ACO1 (1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase 1)是植物内源乙烯生物合成途径的限速酶,与花芽分化和器官衰老密切相关。本研究通过实时荧光定量技术对基因HbACO1在雌雄花、叶、胶乳和嫩皮组织的表达模式进行分析,结果显示基因HbACO1在雄花表达量最高,在雌花、叶和嫩皮中表达量低,在胶乳中几乎不表达。对雄花发育不同时期(小孢子母细胞时期,四分体期和单核小孢子时期)的HbACO1基因表达量分析表明：在不育品种(‘热研7-33-97’,‘PR107’)的四分体和小孢子时期表达量明显高于在可育品种(‘热研93-114’,‘天任31-45’)相应时期的表达量,推测基因HbACO1可能在雄花的四分体及单核孢子期间异常高表达导致了雄花败育现象。利用mRNA原位杂交技术对HbACO1基因进行了原位表达分析,结果显示在不育品种中绒毡层细胞、花药外壁细胞和小孢子母细胞能检测出基因HbACO1的荧光信号,在可育品种中在花柱和花药外壁有荧光信号,推测HbACO1基因可能主要是在雄花的绒毡层、花药外壁和小孢子母细胞特定细胞类型中表达来调控雄花的发育,而在这些细胞类...     

粉蕉MbACS7基因的克隆及表达分析

乙烯合成及其效应是决定香蕉果实成熟的核心要素,其中1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合成酶(ACS)是乙烯合成途径的限速酶。粉蕉果实成熟速度较快,保鲜难度较大。研究粉蕉ACS家族基因的特征和表达模式可为控制香蕉果实成熟进程和延长货架期提供理论依据。本研究从粉蕉中克隆获得一个全长序列为1 458 bp的目的片段,编码485个氨基酸,分子量为54.751 kD,具有PLN02450保守结构域(37～1 377氨基酸),属于ACS基因家族蛋白,因此被命名为MbACS7。理化性质分析表明MbACS7蛋白亲水且不稳定。进化分析表明MbACS7蛋白预测的氨基酸序列与苦瓜(Momordica charantia) ACS蛋白的氨基酸序列(CAE53271.1)遗传关系较近。瞬时表达分析表明MbACS7蛋白在烟草表皮细胞的细胞核中强烈表达,表明该蛋白可能在细胞核中发挥着重要的生理功能。实时荧光定量表达分析表明MbACS7基因在粉蕉果实成熟期表达量最高,为果实发育初期的900多倍。本研究为进一步解析MbACS7基因在粉蕉果实乙烯生物合成中的功能奠定基础,也为改良香蕉果实贮藏性提供基因资源。     

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。     

巴西橡胶树幼叶和成熟叶比较蛋白质组学初步研究

为研究不同发育时期橡胶树叶片的功能代谢及揭示天然橡胶胶乳的合成调控机制,本研究以巴西橡胶树古铜期幼嫩叶片（幼叶）和稳定期完全成熟叶片（成熟叶）为实验材料,提取蛋白并进行双向电泳分离,结果发现幼叶与成熟叶相比,蛋白表达图谱差异显著,鉴定出的已知蛋白中多数参与了碳代谢及蛋白的翻译后修饰功能。本研究建立了成熟的巴西橡胶树叶片比较蛋白质组学研究的技术体系,获得了高分辨率的叶片蛋白双向电泳参考图谱,鉴定出来的腈裂解酶A链,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶和肌动蛋白等在幼叶和成熟叶片中的表达量不同,这些结果为进一步揭示天然橡胶合成调控机制提供了一定的技术支撑与实验数据,对天然橡胶合成机制的研究以及其它热带植物叶片的蛋白质组学研究具有一定的参考意义。     

文心兰OnA CO2基因的克隆及表达分析

乙烯对植物的许多发育过程如切花和果实衰老发挥重要的调控作用,而1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶(ACO)是乙烯生物合成中的限速酶。本研究利用RACE技术克隆得到文心兰On ACO2基因(Gen Bank登录号为KP410730)c DNA,全长1 376 bp,推测为编码324个氨基酸的非跨膜蛋白,分子量为36 413.5,等电点为5.71。On ACO2蛋白的结构域包括DIOX_N和20G-FeⅡ_Oxy,与其它植物的ACO蛋白序列相似性在66%~91%之间。On ACO2基因原核表达获得了与理论分子量一致的重组蛋白。利用荧光定量PCR的表达分析结果表明,On ACO2在蕊柱中相对表达量最大,其次为花萼、侧瓣和叶片,最少的为根、茎和唇瓣。在文心兰切花衰老期间,On ACO2在花的不同部分中表达水平急剧升高,其后乙烯释放速率也对应地剧烈上升。On ACO2基因在文心兰花衰老过程中时空特异性表达表明,所克隆的On ACO2基因是一个对花衰老有作用的功能基因。On ACO2是文心兰品种抗衰老分子改良的重要候选基因,本研究结果可为文心兰切花衰老基因工程育种打下基础。     

ACC处理对不同基因型玉米幼苗响应氮素供给的调控效应

乙烯对玉米生长发育与形态建成具有重要调控作用,但乙烯对玉米氮素吸收与积累调控效应缺乏深入研究,局限了乙烯在玉米丰产高效栽培中的应用。本研究以郑单958、瑞福尔1号和德美亚3号3个玉米品种为试验材料,比较研究不同基因型玉米植株对氮素供给的响应差异,结合外源添加乙烯合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid,ACC),分析乙烯对不同基因型玉米氮素吸收的调控效应。研究结果表明,在低氮条件下,氮素敏感型品种(德美亚3号和瑞福尔1号)比郑单958叶片缺氮表型明显,对ACC处理敏感,而且ACC处理抑制玉米植株地上和地下部的生长和干物质积累;ACC处理抑制了低氮下叶片叶绿素合成,降低叶片可溶性蛋白积累,促进玉米叶片早衰,其中ACC处理郑单958叶片叶绿素和可溶性蛋白含量均显著高于德美亚3号和瑞福尔1号;进一步研究发现,低氮处理抑制乙烯合成关键酶基因ZmACS7和ZmACO15的表达,降低乙烯含量,ACC处理促进低氮条件下ZmACS7和ZmACO15基因的表达,提高乙烯含量;低氮处理抑制玉米根系中ZmNRT2.1表达,但ACC处理促进低氮下玉米根系中ZmNRT2.1表达,其中郑单958根中ZmNRT2.1表达在低氮条件下显著高于德美亚3号和瑞福尔1号。研究结果表明乙烯通过调控玉米植株乙烯合成关键酶基因和ZmNRT2.1表达,调节了氮素吸收与分配,影响了植株生长,其中氮素敏感性品种比持绿型品种对乙烯更为敏感。     

百脉根ACC氧化酶基因LcACO1的克隆及序列分析

植物激素乙烯参与植物生长发育多个生理过程的调控。ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键合成酶。本研究依据其它物种ACC氧化酶序列信息设计简并引物,并结合RT-PCR和快速扩增c DNA末端技术从牧草百脉根中首次克隆到ACC氧化酶基因的全长c DNA序列,命名为LcACO1。LcACO1全长c DNA为1 012 bp,具有一个924 bp ORF可编码307个氨基酸残基。生物信息学分析表明,LcACO1是含有Fe2+依赖的加氧酶结构域的稳定亲水蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与其它植物中的ACO蛋白进行同源性比对显示,LcACO1蛋白与鹰嘴豆中ACO蛋白的一致性高达90%。实时荧光定量PCR表明,LcACO1基因在百脉根不同组织器官中差异表达,根中表达量最高,推测其主要在根的生长发育调节方面发挥作用。     

外源ABA和乙烯利胁迫下斑茅ACO基因表达的实时PCR分析

研究了外源ABA和乙烯利胁迫处理对斑茅1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因（ACO基因）表达情况的影响。在项目组克隆斑茅ACO基因的基础上,应用实时荧光PCR技术分析斑茅ACO基因在ABA、乙烯利胁迫下的表达。结果表明,斑茅ACO基因在ABA的胁迫下,在3h有微弱上调表达,而6h日寸明显抑制,其后表达趋向平缓;在乙烯利的胁迫下,ACO基因在前期受抑制,其后呈明显上调表达,在24h后ACO基因的表达趋向平缓。斑茅ACO基因的表达受乙烯利诱导,而不受外源ABA诱导。     

1—MCP对红星苹果贮藏期间伤乙烯合成的影响

以红星苹果果实为试材，设机械损伤、机械损伤＋1-MCP、对照3种处理，进行贮藏期间伤诱导乙烯的生物合成过程中ACC合成酶（ACS）活性、ACC积累水平、ACC氧化酶（ACO）活性和乙烯释放速率变化的试验研究。试验结果表明，机械伤刺激了果实ACS和ACO活性，促进了果实乙烯释放，加速了果实衰老；而1-MCP则抑制了受伤果实中ACS和ACO活性，提高了受伤果实贮藏后期ACC积累水平，显著地减少了受伤果实乙烯的释放，改善了受伤果实的贮藏品质。     

巴西橡胶树RALF基因家族的鉴定及其表达分析

快速碱化因子(rapid alkalinization factors, RALFs)是一种植物多肽类激素,参与胞内MAPK信号传递、细胞伸长调控、花器官发育及免疫应答等植物重要生理过程。本研究利用生物信息学方法对橡胶树RALF基因家族进行全基因组鉴定,对其序列特性、基因结构、保守基序、系统进化及表达特性进行系统研究。通过同源比对在橡胶树基因组中共鉴定到16个RALF基因,分别命名为HbRALF1～HbRALF16。序列分析结果表明,这些基因编码氨基酸数目介于108～149 aa之间,分子量和等电点分别介于11.92～16.88 kD和5.41～9.33。多序列比对结果表明,HbRALFs含有S1P蛋白酶识别位点、受体蛋白识别位点YISY保守序列和四个保守半胱氨酸。基于转录组数据的组织和乙烯刺激表达特性分析显示,16个橡胶树RALF基因至少在一个组织中表达,8个胶乳中高表达的RALF还参与乙烯刺激响应。本研究为进一步研究RALF基因家族在橡胶树关键农艺性状调控中的作用提供参考依据。     

橡胶草SRPP5基因的克隆及生物信息学分析

天然橡胶是产胶植物中合成的聚异戊二烯高分子化合物,而小橡胶粒子蛋白是橡胶粒子膜上参与天然橡胶分子链延伸的关键因子,与橡胶的产量和质量密切相关。本研究利用PCR技术从橡胶草中克隆得到TkSRPP5基因全长序列并进行生物信息学分析。结果表明,该基因含有一个长度为654 bp的开放阅读框,并编码217个氨基酸,所编码蛋白的分子量为23.31 kD,理论等电点为4.58。TkSRPP5为亲水性蛋白,具有24个磷酸化位点,亚细胞定位预测在细胞质中。该蛋白属于SRPP家族,二级结构主要存在α-螺旋和无规则卷曲结构,与预测的蛋白质三级结构一致。系统进化树分析表明,该蛋白与菊苣的SRPP蛋白有着最近的亲缘关系。本研究为进一步了解TkSRPP5基因的功能和其在橡胶草胶乳合成中的作用机制提供了理论依据。     

Md-ACO1和Md-ACS1基因对苹果乙烯生产和保存期限的作用

保存期限将决定刚收获或保存的成熟苹果的经济寿命时间。较长的保存期限是与室温下果实硬度的缓慢下降高度相关的。苹果是一种有跃变期的果实，其果实硬度的丧失好象在生理学上与乙烯有关。乙烯的生物合成途径受到编码1-氨基环炳烷-1-羧化物合成酶（ACS）和1-氨基环炳烷-1-羧化物氧化酶（ACO）的这两大类基因的控制。本研究利用基因特定分子标记来检测了ACS和ACO基因对苹果乙烯生产和保存期限的影响，     

巴西橡胶树排胶机制研究进展

橡胶树是世界上商业用天然橡胶最主要的来源,排胶是天然橡胶生产的最后关键环节,为了安全高效的获取胶乳产量,橡胶树排胶机制的研究一直受到人们的重视。橡胶树中的乳管是天然橡胶合成和储存的组织,人们通过割胶收集从乳管中流出的胶乳用作提炼天然橡胶。胶乳的排出速度及排胶持续时间是决定天然橡胶产量的重要因素,是排胶动力和排胶阻力共同作用的结果。笔者对与排胶相关的乳管细胞学基础、排胶主要初动力的乳管膨压、排胶继动力的乳管胶乳水分稀释效应以及乳管排胶阻力的形成及其调控机制等研究进行了归纳,主要分析了乳管伤口堵塞物的形成和影响排胶阻力的多种因素,指出乳管堵塞在胶乳的停排中起重要作用。针对目前排胶机制的研究进展缓慢这一现状,我们提出有必要从以下几点展开深入研究：（1）乳管膨压形成相关的树皮木质素合成和调控;（2）水分运输相关的水通道蛋白基因表达和活性分析;（3）停排相关的乳管伤口末端堵塞物的形成和调节。这些研究将为全面解析橡胶树排胶机制奠定基础,也可为分子辅助育种-选育排胶通畅的种质提供依据。     

橡胶树中碱性转化酶基因HbNIN7的克隆与表达分析

蔗糖主要由植物光合作用产生,其水解依赖于转化酶和蔗糖合成酶。其中,转化酶催化蔗糖不可逆分解为葡萄糖与果糖。本研究基于橡胶树的基因组和转录组数据库,采用RT-PCR技术克隆得到一个中碱性转化酶基因HbNIN7基因,预测编码683个氨基酸。同源与亚细胞定位分析表明HbNIN7属于α类中碱性转化酶,定位于线粒体。通过原核表达获得其重组蛋白,酶活性分析表明,HbNIN7重组蛋白最适酶活pH值7.2;最适酶活温度45℃;最大反应速率32.69 mmol hexose·mg^-1protein·h^-1;Km值25.04 mmol/L。利用荧光定量方法分析基因的表达特征,结果显示:HbNIN7基因在雄花中表达水平最高,且在雄花发育的不同阶段差异显著,说明Hb NIN7很可能参与橡胶树花组织中糖利用及糖信号调控。     

橡胶树皮乳管组织茉莉酸诱导相关因子AP2/EREBP基因的克隆与表达分析

摘要：茉莉酸（jasmonic acid,JA）可诱导橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）乳管分化,是乳管分化的关键信号分子。目前,对JA诱导橡胶树乳管分化的分子机理仍然不清楚。我们在前期研究中通过筛选JA刺激乳管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库,获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST。本研究在此基础上,采用RACE法完整地克隆了这4个AP2/EREBP转录因子基因的开放阅读框,蛋白氨基酸序列分析表明其中3个属于ERF亚类,1个属于RAV亚类;表达分析发现,这4个基因在乳管分化时期的橡胶树树皮组织的表达受JA诱导,随JA处理时间的延长,其表达量先增强后减弱,推测它们可能在JA诱导橡胶树乳管分化过程中起着重要的调控作用。     

巴西橡胶树逆境相关HbCPK1结构与功能分析

钙依赖型蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPK,CPK)在植物对生物和非生物胁迫抗性中具有重要作用。为揭示橡胶树CPK家族成员在橡胶树白粉病抗性中的作用,从巴西橡胶树‘热研7-33-97’叶片中克隆了一个CPK基因,其推导氨基酸含有特征性蛋白激酶家族结构域和4个EF手型蛋白结构域,命名为HbCPK1。该基因在花、叶片、胶乳和树皮中均有表达,在花中表达量最高。干旱、机械伤害和白粉病浸染均显著上调该基因在橡胶树叶片中表达。表明HbCPK1主要受非生物胁迫反应诱导,参与橡胶树对逆境响应,本研究为阐明HbCPK1基因在橡胶逆境胁迫响应下的作用提供理论参考。     

橡胶树中碱性转化酶HbNIN9表达及酶学特性分析

转化酶作为蔗糖分解代谢的关键酶,在植物生长发育、生物与非生物胁迫响应等生理过程中发挥重要作用。基于对橡胶树不同组织转录组数据库的分析,本研究克隆了一个在橡胶树种子中有较高丰度表达的中碱性转化酶基因HbNIN9;系统进化分析和在线软件预测均显示其亚细胞定位为线粒体,属于中碱性转化酶α亚族成员;利用原核表达体系成功获得Hb NIN9优化表达的重组蛋白,优化表达的诱导条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃培养6 h;酶学特性分析表明,HbNIN9蛋白酶活反应的最适温度为45℃,最适pH值为7.5,米氏常数Km值为18.09 mmol/L。本研究从蛋白水平证实了Hb NIN9为典型的中碱性转化酶,有助于深入揭示线粒体型转化酶在橡胶树种子糖代谢中生理功能,丰富橡胶树中碱性转化酶家族成员的生理生化研究。