不同发根农杆菌菌株对番茄毛状根诱导率及阳性率的影响

为了提高番茄毛状根的发根效率,试验以野生型番茄品种Ailsa Craig(AC)为材料,分别使用发根农杆菌菌株Ar Qual、MSU440、C58C1、K599对其进行番茄毛状根诱导,以研究4种不同的发根农杆菌菌株对番茄转基因毛状根诱导率及阳性率的影响。结果表明：发根农杆菌菌株的不同对番茄毛状根诱导率及阳性率均有影响。其中,Ar Qual的发根诱导率最高,约为90.4%,毛状根阳性率约为60.7%;其次是MSU440,发根诱导率约为47.3%,毛状根阳性率约为52.3%;K599、C58C1的发根诱导率较低,分别约为2.5%、0.6%,毛状根阳性率分别约为65%、33.3%。通过该研究找到了更适宜番茄毛状根转化的菌株Ar Qual,这对优化番茄毛状根转化体系,快速获得番茄转基因根系植物材料以开展基因功能、南方根结线虫等方面的研究工作有重大意义。     

发根农杆菌转化银杏等药用植物研究进展

利用发根农杆菌转化药用植物,并对毛状根进行离体培养,大量提取重要成分,是药用资源植物可持续发展的有效途径之一。讨论了发根农杆菌影响发根诱导的因素即转化组合的研究、转化条件的研究及影响发根生长量和有效物质含量的研究进展,并对其发展前景和今后的研究方向及重点进行了展望     

罗汉果遗传转化受体再生体系的建立及发根农杆菌转化初探

以罗汉果品种“青皮果”试管苗的茎段和叶片为外植体,研究适合于遗传转化的受体再生系统,并进行了发根农杆菌转化的初步研究。试验结果表明茎段的再生能力强于叶片,且对农杆菌敏感,是进行遗传转化合适的受体材料。在MS基本培养基附加BA 1mg/L、KT 1mg./L、NAA 0.2mg./L、蔗糖30 mg/L培养基中,20d龄的茎段不定芽诱导率为100%,平均每个外植体诱导的不定芽数达到9.7个,移苗成活率90%以上;外植体培养前的割伤处理有利于提高出芽数;发根农杆菌转化茎段诱导出毛状根。罗汉果毛状根的诱导和培养将为罗汉果药用成分的研究和开发提供新的途径。     

发根农杆菌介导的向日葵遗传转化

本研究首次报道了发根农杆菌介导的向日葵遗传转化和毛状根形成的优化条件。由发根农杆菌诱导向日葵子叶和下胚轴形成的根在含卡那霉素（200 mg/L，kanamycin）的选择培养基(1/2 MS)上选择，12 d后存活的根转到无激素培养基上能快速生长，经分子检测证实其为毛状根。同时着重研究了不同诱导条件对向日葵毛状根形成的影响。结果发现适用于毛状根形成的最优条件为菌株R1205，菌液浓度（OD₆₀₀）1.0，15 min感染，共培养3 d，培养基pH 6.5，30 μmol/L乙酰丁香酮（acetosyingone）。在此条件下，子叶和下胚轴的毛状根形成率分别达到23.7％和81.6％。     

西兰花毛状根悬浮培养体系建立

为建立西兰花毛状根高增殖能力悬浮培养体系,实验对通过发根农杆菌ATCC15834浸染西兰花叶片获得的毛状根进行PCR检测,高增殖液体悬浮培养体系条件的优化,毛状根生长动态与萝卜硫素合成动力学研究。实验结果表明,诱导出的毛状根整合了发根农杆菌ATCC15834的rol B基因。毛状根液体悬浮培养的最佳条件为:接种量为1mg/mL、转速为110r/min、培养基体积100mL、培养温度为25℃,增殖倍数达26.47倍。毛状根悬浮培养生长分为迟滞期、分化期、增殖期、静止期、衰亡期五个时期,萝卜硫素的合成于培养的静止期,并向培养基中少量释放,且最佳收获时间为接种后的第21天。这一研究结果可为次生代谢产物萝卜硫素的生产提供一定的理论基础。     

刺五加毛状根诱导条件的研究

为研究影响刺五加毛状根产生的因素,以农杆菌R15834、R1601、C58C1为试验菌株,叶片、叶柄、幼茎为外植体,探讨发根农杆菌种类、菌液浓度、共培养时间和乙酰丁香酮(As)等因素对刺五加毛状根转化率的影响。结果表明菌株R15834以浓度OD600=0.4左右对刺五加毛状根的诱导能力较好;叶片诱导毛状根能力较好;共培养时间以4天左右为最佳;As浓度以400 μmol/L左右有利于促进刺五加毛状根的产生。试验对刺五加毛状根的诱导体系进行了比较系统的研究,为产业化生产毛状根工作提供参考。     

谷子毛状根诱导方法的建立与优化

为建立一种快速鉴定谷子基因功能的技术体系,本研究通过比较谷子外植体、品种、乙酰丁香酮、菌液浓度和共培养时间对发根农杆菌K599介导的毛状根诱导效率的影响,发现发根农杆菌浓度在OD600为0.5、以谷子芽尖为外植体、在含有100μmol L–1乙酰丁香酮的毛状根诱导培养基上共培养3 d时,可使毛状根诱导率高达80.24%。将GFP基因进行毛状根遗传转化,通过GFP基因的PCR扩增和GFP荧光观察结果分析,发现谷子毛状根的转基因效率大于70%。利用该体系对谷子SiDVL1和SiDVL3的亚细胞定位和SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7基因功能进行了分析和鉴定。结果表明SiDVL1和SiDVL3在谷子毛状根中的亚细胞定位与在烟草叶片中的一致;SiNHX2、SiCBL4和SiCBL7转基因谷子的存活率显著高于空载体转化谷子。说明本研究建立了一种高效快速鉴定谷子基因定位和功能的方法。     

乌拉尔甘草毛状根的诱导及离体培养

为获得甘草的药用成分和保护甘草野生资源,利用发根农杆菌ATCC15834、A4 侵染乌拉尔甘草幼苗、子叶、下胚轴,获得毛状根,建立了乌拉尔甘草毛状根培养系统,经PCR和毛细管凝胶电泳检测,在248 bp 有rolA 基因,在490 bp 有rolC 基因,证实发根农杆菌基因片段在甘草毛状根的基因组中整合并得到表达,其中无菌实生苗毛状根诱导率达79.5%,毛状根分枝较多,生长速度快,在不添加激素的1/2MS液体培养基中生长明显,培养25 天后,鲜重平均增殖达19.13 倍,乌拉尔甘草毛状根培养体系的建立为进一步利用生物反应器规模化培养甘草药用活性成分提供了参考。     

四倍体菘蓝毛状根的诱导及其植株再生

利用发根农杆菌A4和R1000感染四倍体菘蓝子叶,毛状根诱导频率和得根率分别达72.5%和27%以上.A4诱导四倍体菘蓝毛状根优于R1000,光照对毛状根的诱导起着重要作用,外源激素IAA能明显地促进毛状根的诱导作用.rolB、rolC基因的PCR分析表明,Ri质粒中的T-DNA片段已整合到毛状根细胞基因组中.毛状根能在不含激素的MS固体培养基上分化出不定芽,6-BA能促进毛状根不定芽的诱导;NAA促进不定芽生根,再生完整植株.     

栽培型与野生型青蒿愈伤组织及毛状根的诱导

为了比较栽培型与野生型引种青蒿愈伤组织及毛状根的诱导差异,以2种类型青蒿种子为材料,在不加激素的MS培养基中诱导青蒿苗,并利用青蒿的根、茎和叶片在MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L诱导愈伤组织,发根农杆菌C58C1、ATCC15834和Accc10600诱导毛状根。结果表明青蒿愈伤组织诱导效率以根最佳,其次为茎和叶片。农杆菌C58C1和ATCC15834分别以青蒿的根和叶片的诱导率可达100%和70%;Accc10600菌种不能诱导青蒿叶片毛状根发生,但是可诱导根生出毛根的芽点。该研究为青蒿素的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

芥菜型油菜毛状根诱导体系构建及TTG1基因功能初步研究

黄籽油菜具有种皮薄、出油率高等优点, 研究油菜黄籽的形成具有重要的意义。前期研究表明, TTG1 (TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)基因参与了油菜种皮颜色的形成。本研究利用发根农杆菌A4菌株诱导了芥菜型油菜四川黄籽的毛状根, 并研究了菌液浓度和外植体部位对诱导率的影响。结果表明, 菌液浓度OD值为0.8时, 诱导效率最高, 平均为71.5%; 外植体中下胚轴的发根率最高, 平均为87.3%。在四川黄籽毛状根中过表达TTG1基因, 发现原花色素合成途径中的DFR (dihydroflavonol4-reductase)、ANS (anthocyanidin synthase)和BAN (anthocyanidin reductase)基因的表达受到抑制。本研究优化了油菜毛状根的诱导体系, 为利用毛状根体系进行基因功能验证提供了新的思路和方法。     

白木香毛状根的诱导及外源基因的导入

沉香是名贵药材之一,白木香(Aquilaria sinensis)是沉香的唯一基源植物。为明确外植体和诱导条件对白木香发根的影响,本研究利用发根农杆菌SW101侵染白木香无菌苗,并将携带gfp基因的载体转入SW101后诱导发根。结果显示,当子叶、叶片和茎段作为外植体时,最适诱导发根条件为MS+200μmol/L乙酰丁香酮的固体培养基上于25℃(12 h光照)预培养2 d后,于28℃,180 r/min条件下发根农杆菌侵染10 min。相同诱导条件下,以子叶为外植体的发根率为69.6%,以叶片和茎段为外植体的发根率为50.0%。本研究成功将外源基因gfp导入诱导产生的毛状根中,PCR可检测到外源基因的插入;荧光显微镜下可观察到绿色荧光。利用这一体系可以稳定表达外源基因,可作为白木香功能基因解析和结香机理研究的技术支持。     

R2R3-MYB转录因子GmMYB184调节大豆异黄酮合成

异黄酮是一类主要含在豆科植物中的次生代谢物, 在植物防御体系中发挥重要作用, 并与人类健康密切相关。大豆异黄酮含量受多基因和复杂代谢网络控制, 调控代谢途径上的结构基因不能显著改变大豆异黄酮含量, 与异黄酮代谢途径相关的转录因子的鉴定和应用可能会有效解决这个问题。本研究克隆了一个与大豆异黄酮合成相关的R2R3类型MYB转录因子GmMYB184, 并进行了初步的功能验证。亚细胞定位研究结果表明GmMYB184转录因子定位于细胞核。组织表达分析结果表明该转录因子基因与IFS2 (异黄酮合酶2编码基因)的表达模式相同。同时, GmMYB184和IFS2的表达模式与异黄酮的积累模式相似。谷胱甘肽诱导表达分析表明该转录因子基因与IFS2共同被诱导, 说明这两个基因可能参与同一或相似的生物过程。采用双荧光素酶报告系统分析其对异黄酮合成途径关键基因的转录激活活性影响, 发现GmMYB184能够促进IFS2和CHS8启动子表达活性分别提高5倍和7倍。最后, 通过发根农杆菌介导的遗传转化系统, 找到该转录因子在异黄酮合成调控中的直接作用证据。沉默GmMYB184导致大豆毛状根异黄酮含量的显著下降。但是, 过表达GmMYB184不足以显著提高毛状根中异黄酮的含量。总之, 本研究为大豆异黄酮合成分子机制探索及大豆异黄酮品质改良提供了理论依据。     

二倍体马铃薯基因编辑载体快速验证体系的建立

基于马铃薯熟性基因StCDF1的序列,构建了含有绿色荧光蛋白CRISPR/Cas9-StCDF1载体,并建立了农杆菌介导二倍体马铃薯遗传转化快速验证基因编辑载体的实验体系。结果表明,在发根农杆菌介导的遗传转化过程中,在生根培养基中添加2mg·L^-1的抗生素特美汀,能有效抑制发根农杆菌且不影响发状根的生长。利用荧光检测可实现对转化再生的阳性发状根进行快速筛选。结合对阳性根中拟编辑靶标序列的测序分析,发现所筛选出的阳性发状根中出现多种缺失类型,证明所构建的基因编辑载体和荧光筛选方法的可靠性。进一步利用根癌农杆菌介导转化马铃薯茎段,通过稳定的遗传转化最终获得1株StCDF1缺失5bp的杂合突变体。本研究在二倍体马铃薯中建立了快速验证基因编辑载体的方法,并获得了1株基因编辑植株,为后续研究StCDF1基因的调控网络提供了材料。     

中国甘草的组织培养研究进展

概述了国内在甘草植株再生、快速繁殖和毛状根培养方面的研究进展情况。甘草组织培养的基本培养基为MS,诱导培养基主要附加激素为2,4-D、6-BA和NAA,其中6-BA(0.2￣1.0mg/L)必不可少;分化培养基以MS无机元素和B5的有机成分为基本培养基,并附加ZT、BA、KT,三者可单独使用或配合NAA使用;生根培养基主要是添加NAA(0.05￣0.01mg/L)。能分化成苗的外植体仅有下胚轴,而且分化率极低,仅为3%￣6%。快速繁殖方法有腋芽丛状茎生根成苗和带叶茎段直接生根成苗两种,其中带2叶茎段成苗繁殖系数最高,达到98%。发根农杆菌ATCC15834感染甘草下胚轴诱导产生毛状根效果最好,诱导率高达30%。毛状根的最佳培养条件是:50mg/LKNO3,100mg/LCaCl2·2H2O,0￣225mg/LKH2PO4,640mg/LMgSO4·7H2O,微量元素及有机物质采用B5水平,32.5g/L蔗糖,转速100r/min,pH6.2左右,通过毛状根的培养可获得原植物中含有的或者不含有的化合物。     

根癌农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展

在植物遗传转化研究的进展中,因根癌农杆菌具有转入的外源DNA结构完整、外源基因表达比较稳定、经济简便、技术仪器要求低等优势,成为了目前应用较为广泛的转基因技术。对根癌农杆菌介导单子叶植物的发展状况、影响因素和提高转化效率进行了综述,以期为提高单子叶植物遗传转化效率和转化技术提供参考依据。     

人参发状根的相关研究进展

人参发状根具有生长速度快、激素自养、皂苷含量高等特点,是大规模生产人参皂苷的有效途径。本综述在发根农杆菌转化机理、诱导体系建立、发状根鉴定研究的基础上对Ri质粒作用机理、影响诱导率的因素、人参发状根的形态及分子鉴定进行了重点分析,并对今后急需研究的几个方向进行了展望,以期为人参发状根的有效开发和合理利用提供参考。     

皂荚类胡萝卜素合成途径基因表达分析及miRNA调控的鉴定

皂荚是豆科皂荚属落叶乔木,具有较高的生态价值和药用价值。研究相关基因的表达、调控及功能,是分子改良植物的重要前提,而目前对皂荚基因表达调控的研究鲜有报道。为了探究皂荚荚果成熟过程中类胡萝卜素合成途径的基因表达和调控,本研究基于皂荚荚果两个不同发育期(7月, 9月)的转录组高通量测序结果,发现合成类胡萝卜素关键前体番茄红素的合成酶基因(CrtQ)在皂荚荚果成熟早期被显著抑制,而负责内源激素脱落酸(ABA)的合成酶基因(AAO3)被显著诱导;另外,研究发现miR838-3p可调控类胡萝卜素途径中合成番茄红素的前体的酶基因(CrtB)。本研究结果表明,类胡萝卜素途径中色素合成过程被miR838-3p抑制进而诱导脱落酸的合成从而在皂荚荚果成熟中起着重要作用,并可能会反馈促进次生代谢物皂苷的生成。研究首次鉴定了皂荚荚果发育中类胡萝卜素合成途径基因的表达模式,并揭示了miRNA的调控,该结果可为提高皂荚抗逆性或遗传改良荚果内重要次生代谢物皂苷含量提供分子线索和依据。     

金铁锁毛状根皂苷的薄层色谱分析及抑菌活性

为了评价金铁锁毛状根的药用价值,对毛状根中主要活性成分皂苷进行分析,以及对毛状根提取物的抑菌活性进行检测。采用硅胶色谱法对毛状根中主要活性成分皂苷进行分析;采用牛津杯法以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌作为指示菌对毛状根提取物进行抑菌活性检测。发现氯仿:乙酸乙酯:甲醇:水(15:40:22:10)的展开系统分离的皂苷谱带效果好;与野生金铁锁药材相比,毛状根组织中也含有7种相同皂苷,另外7种皂苷未检出,但毛状根中出现2种新皂苷,而且毛状根组织中有3种低极性皂苷含量明显高于金铁锁药材。金铁锁毛状根的乙醇提取物对三种指示菌都有较强的抑制效果,优于金铁锁野生药材的抑菌效果。研究结果表明,金铁锁毛状根组织新合成的低极性皂苷可能是毛状根抑菌性强于野生药材的原因之一,但需要进一步研究新皂苷的生物合成机理、生理学意义和药物活性等。本研究结果为现如今在金铁锁毛状根方面的研究填补了空白,也为其后续的深入研究做了铺垫,对金铁锁毛状根未来的进一步开发起到重要的引导作用。     

逆境启动子的鉴定及在大豆中的应用

为减少抗逆分子育种中因引入外源抗性基因造成的基因多效性,降低外源基因对植物的伤害,本研究设计并合成逆境响应顺式元件不同组合的启动子,将其连上GUS报告基因后转化为拟南芥野生型Col-0;通过转基因拟南芥中GUS报告基因的表达强度分析各种启动子对干旱和盐害的响应情况,筛选出了在正常条件下无渗漏、在干旱和盐害胁迫下被诱导的启动子AXpro。然后,利用发根农杆菌介导转化大豆,发现干旱诱导生物钟基因GmTIC的沉默能提高大豆的抗旱能力。研究结果为农林业的抗逆分子育种提供了理论基础和应用方法。