基于转录组数据解析大花君子兰花瓣花青素代谢差异

大花君子兰是世界上重要的观赏植物,其花瓣颜色在花蕾不同发育时期具有显著差异。本研究通过对花蕾3个不同发育时期花瓣进行高通量转录组测序,进而探讨君子兰花瓣发育过程中与其花色相关的基因表达情况。结果表明,共获得167 078条转录本,平均长度为673 bp,有67 512条Unigenes在各数据中被注释。GO功能富集中有24 162条基因被注释,分为分子功能、细胞组分和生物过程3大类和50个亚类。KEGG代谢通路注释中,12 930条被成功注释,主要富集与花青素合成相关的通路,包括苯丙素生物合成途径、类黄酮生物合成途径、异黄酮生物合成途径、花青素生物合成途径和苯丙氨酸代谢生物合成途径。君子兰花蕾在3个发育时期时花青素合成途径中一些关键酶(如CHS, CHI, DFR)和调控基因(MYB和bHLH)的表达量出现了显著差异。     

杜仲雌花芽2个发育时期转录组分析

杜仲(Eucommia ulmoides)的果实是提取杜仲胶和杜仲籽油的重要原材料,在工业、医疗、食品等领域开发前景广阔。为了揭示雌蕊原基发育相关基因的表达情况,本研究以杜仲果用良种‘华仲6号’(Huazhong No.6)为材料,利用lllumina Hiseq X-10高通量测序平台,分别对花序原基分化期和雌蕊原基分化期的花芽进行转录组测序,通过生物信息学对2个发育时期的雌花芽转录组进行比较分析,筛选出与杜仲雌蕊原基发育相关的差异基因。结果显示,转录组测序共获得68.11 Gb数据,各样品的Clean reads与杜仲基因组进行序列比对,比对效率为91.59%~92.05%,同时2个发育时期共筛选出485个差异表达基因,其中219个差异基因在雌蕊原基分化期表达上调,266个表达下调。差异基因GO富集结果表明,花的发育、光周期现象、激素生物合成以及蛋白结合转录因子活性等相关的生物途径被富集。KEGG富集结果表明淀粉和蔗糖代谢、碳代谢、昼夜节律和植物激素信号转导等代谢通路被富集。结果表明光周期途径是诱导杜仲成花的重要途径,且雌蕊原基发育受碳水化合物、植物激素和其他代谢物质调控。本研究为杜仲花器官发育调控基因的挖掘提供了基础数据,也为果用杜仲的分子育种提供了参考。     

甘蓝型油菜种子发育灌浆后期的转录组分析

油菜种子发育是产量和品质形成的关键发育阶段,包含了复杂的发育过程和调控网络,有效地解析种子发育的转录调控机制具有重要的意义。以甘蓝型春油菜品种青杂5号为研究材料,利用RNA-seq技术对种子发育的后期(30-DAF,40-DAF)2个发育时间进行转录组测序,筛选差异基因,并利用GO数据库和KEGG数据库注释差异基因功能和可能参与的调控途径。结果表明,从油菜种子灌浆后期的2个时间点的转录组中分别检测到70 850和65 193个表达基因,筛选得到2 654个差异表达基因,其中1 941个基因下调表达,713个基因上调表达,29个基因表达差异倍数|log2Ratio|≥10。GO基因功能分析显示,生物学途径中富集最显著的条目是染色质组装相关的等生物学过程,分子功能方面富集最显著的条目依次是蛋白质代谢、营养库活性等功能类别,而在细胞组件方面富集最显著的条目是染色体相关的等细胞组件。Pathway显著性富集分析显示注释基因最多的途径是次生代谢途径,其次是淀粉、蔗糖代谢途径、苯丙素生物合成途径中的、碳代谢途径和氨基酸生物合成途径。甘蓝型油菜种子发育后期的转录组分析表明,种子发育30-DAF时期次生代谢物、脂质代谢等表达活跃,40-DAF时期逐渐转变为蛋白质、氨基酸生物合成、光合碳代谢、碳代谢等表达活跃,提示油菜种子灌浆后期仍处于复杂的物质与能量代谢调控过程。     

猪毛菜不同部位转录组特征分析

本研究以猪毛菜的地上部分和地下部分为实验材料,通过转录组测序分析探讨猪毛菜不同组织部位的基因表达特征和代谢物质形成有关的基因调控。测序数据分析结果显示获得192 777条转录本序列。差异表达筛选得到14 424个差异基因,其中上调表达基因6 137个,下调表达基因8 287个;GO功能富集分析得到14 424个差异基因。差异基因与KEGG数据库进行比对,共有5 169个差异基因注释在138个通路上,其中参与次生代谢途径共11条通路呈显著性富集。进一步分析黄酮类化合物合成和异喹啉生物碱生物合成通路中的差异基因和其对应的相关酶。随机选取了黄酮类化合物合成通路上的8个基因,通过RT-qPCR分析验证了转录组数据的准确性。本研究利用高通量测序技术和生物信息分析获得猪毛菜不同部位的转录组信息特征,为猪毛菜的药用成分研究和基因功能鉴定提供了科学依据。     

烟草叶片响应镉胁迫的差异表达基因鉴定及分析

烟草具有超富集镉的能力,严重降低烟叶品质,影响其经济价值。为了阐释烟草响应镉胁迫的分子机制,本研究采集了镉浓度为0和500μmol L^-1培养条件下的烟草叶片进行转录组测序。共获得76.94 Gb有效数据(Clean data),Q30碱基百分比均达到95.43%以上;在镉胁迫的烟草叶片中,共筛选出7735个差异表达基因,其中4833个基因表达上调,2902个基因表达下调,并通过qRT-PCR分析验证了转录组数据的可靠性。对差异转录本进行GO和KEGG富集分析,GO注释表明差异基因涉及代谢过程、应激反应、细胞结构体、催化活性和转录调节活性等;KEGG富集分析表明上调差异基因主要富集在氨基酸的生物合成、碳代谢、氧化磷酸化和柠檬酸循环等通路,下调差异基因则主要富集在光合作用、次生代谢产物的生物合成、代谢途径和植物激素信号转导途径。进一步分析植物激素信号转导通路发现,共有8条植物激素途径以不同的表达方式参与烟草对镉胁迫的响应。激素喷施烟草的实验结果表明,叶片通过调控赤霉素、油菜素内酯和茉莉酸途径以应对镉胁迫;拟南芥激素信号缺失突变体验证实验表明赤霉素、油菜素内酯、茉莉酸...     

洋葱转录组测序及黄酮类化合物合成相关基因的分析

洋葱是世界范围内种植的重要蔬菜作物,其鳞茎颜色是洋葱选育和食用的重要性状。本研究对紫皮洋葱和黄皮洋葱进行高通量转录组测序,挖掘黄酮类化合物合成的基因,探讨不同皮色形成的分子基础。本研究共获得5 809个差异表达基因,包括2 991个上调表达基因,2 818个下调表达基因。差异基因GO功能富集分析显示,差异基因主要参与细胞组分、生物过程和分子功能3大类。KEGG显著富集分析显示,差异表达基因主要富集在3条代谢途径上。黄酮类化合物合成相关的通路有类黄酮合成途径、花青素合成途径、异黄酮合成途径、黄酮和黄酮醇合成途径,并筛选出了F3’H、FLS、CHI和DFR等黄酮类合成相关的结构基因。本研究为进一步探讨洋葱皮色相关的代谢合成途径关键酶的功能及其调控机制提供了基础。     

白芨块根生长发育转录组分析

本研究以1年生、2年生和3年生的白芨根为研究材料,通过BGISEQ-500高通量测序平台进行转录组测序,测序结果共获得76 552条Unigenes序列。与七大数据库相似性比对结果显示,得到注释的Unigenes共有52 219条,占所有Unigenes的68.12%。对3个不同年限的白芨根转录组数据进行比较分析,共发现37 825条差异基因,涉及了47种生物功能,可划分为分子功能、细胞组分和生物学过程三大类。通过KEGG富集分析发现共涉及134条信号通路,主要的信号通路为代谢通路和次生代谢产物合成通路。共有59条关键酶差异基因参与了甘露糖的合成途径,多条途径参与了葡萄糖的合成;12条根膨大相关的差异基因参与了白芨根的膨大生长调控。RT-qPCR分析验证了与根膨大和糖代谢相关的6个具有代表性的基因表达与转录组结果趋于一致。本研究结果为进一步深入研究白芨根生长发育和活性成分的生物合成的分子调控机制提供理论依据。     

基于转录组学的不同色系蝴蝶兰花色苷差异积累分析

蝴蝶兰花色丰富且极具变化,是研究花着色机制的理想材料。本研究利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较三种不同色系蝴蝶兰花器官转录组,鉴定蝴蝶兰花色苷合成的相关基因,从转录组水平揭示蝴蝶兰花色苷生物合成的分子调控机制。选取白花蝴蝶兰(PAPW)、红花蝴蝶兰(PAPR)和黄花蝴蝶兰(PAPY)为试验材料,对其花苞及盛开花朵分别釆样,分别提取三个样品的总RNA,利用Illumina Hiseq 2 000进行测序分析,过滤处理后分别得到总Clean reads片段为60 031 912、57 685 822和55 765 402个,GC含量分别为47.78%、47.36%和49.48%,平均长度约为575 bp,N50长度为940 bp,对获得的All-unigenes进行功能注释,注释到Swiss-Prot、Nt、KO、Nr、GO和KOG数据库的Unigenes分别是22 321、19 199、8 671、28 952、20 152和10 380个;PAPR和PAPW相比差异基因共有642个,上调基因有354个,下调基因有288个;PAPY和PAPW相比差异基因共有2 459个,上调基因有132个,下调基因2 327个;KEGG代谢分析表明,2个对比组中的差异基因富集在不同代谢通路中。PAPR和PAPW差异基因主要富集在类黄酮生物合成,苯丙氨酸代谢和钙信号通路等代谢通路,其中类黄酮生物合成中差异基因为8个(7个上调,1个下调)。PAPY和PAPW差异表达基因主要富集在DNA复制,烷、哌啶和吡啶生物碱和细胞凋亡等代谢通路,其中,参与到淀粉与蔗糖代谢中的差异基因最多,有34条(1个上调,33个下调)。这些信息为蝴蝶兰不同花色苷形成相关关键基因的研究提供了重要依据。     

干旱胁迫下枇杷叶片的转录组分析

分析干旱胁迫下枇杷叶片的转录组,挖掘功能基因并对其差异表达基因进行筛选和分析,为枇杷抗旱提供理论依据。利用新一代高通量测序技术测序,对测序结果进行de novo拼接、功能注释和ORF预测,将差异表达基因在COG、GO和KEGG数据库中进行比对注释。测序结果表明,获得转录本共88 530个,平均长度为740.64 bp,ORF41 748条。COG、GO和KEGG数据库将转录本分别划分为24,54个功能类别及291条代谢通路中。25 197个差异表达的基因在30条代谢通路中显著富集,与酶活性、激素合成代谢和信号转导等相关的差异基因积极响应枇杷干旱,其中双萜类、油菜素类固醇和类胡萝卜素3条生物合成途径中的差异基因呈现出较为一致的表达。采用实时荧光定量(qRT-RCR)对选取的差异基因进行验证,其中过氧化物酶、蛋白激酶byr2、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、脱落酸8'-羟化酶、吲哚-3-乙酰乙酸合酶相关基因上调表达,细胞色素P450 734A1基因下调表达。为枇杷提供了较为全面的基因信息和代谢途径数据,为干旱胁迫下枇杷分子调控机制的深入研究奠定了基础。     

人参种胚不同后熟发育阶段比较转录组学分析

胚后熟发育对人参种子休眠解除具有重要影响。为探索人参胚后熟发育的分子机制,本研究利用Illumina Hi Seq X-ten平台对人参种子五个后熟发育时期(心形胚,鱼雷胚,子叶胚,成熟胚和芽胚)的胚组织进行转录组测序,共获得412 604 390条高质量reads。以心形胚为对照,在鱼雷胚、子叶胚、成熟胚和芽胚时期分别鉴定到2 359个、3 048个、6 180个、12 067个差异表达基因(DEGs),去重复后四个时期共获得13 724个DEGs。GO富集分析显示,四个时期的和总的DEGs主要共同富集到催化活性、细胞和发育过程等GO条目。与种子休眠结束中胚发育相关的DEGs编码蛋白构成的蛋白互作网络分析显示,指导m RNA合成的RNA聚合酶Ⅱ第二大亚基(NRPB2)、脯氨酸合成的关键酶Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1和P5CS2)为核心节点蛋白,它们可以通过调控mRNA合成、脯氨酸合成和与其互作蛋白的表达来影响人参种胚的发育。KEGG富集分析发现,四个发育时期的DEGs主要共同富集到代谢过程、次生代谢合成和植物激素信号转导通路。其中,在植物激素信号转导通路中参与生长素和脱落酸信号转导的DEGs最多。因此,我们认为NRPB2、P5CS1、P5CS2蛋白互作和植物激素信号转导可能对人参胚的后熟发育至关重要。本研究结果对揭示人参胚的发育和种子休眠解除的分子调控机制有一定的参考意义。     

红皮红肉和红皮白肉火龙果果肉呈色相关基因差异表达分析

火龙果为热带新兴水果,常见的有红皮红肉和红皮白肉两种类型。为探究这两种火龙果果色差异原因,发掘差异表达基因(differencially expressed genes, DEGs),本研究分别在青果期(授粉后第15天)和成熟期(授粉后35 d)采集红皮红肉火龙果(Hylocereu polyrhizus)和红皮白肉火龙果(Hylocereu undatus)的果肉样品,进行转录组测序。获得高质量序列共53 240条。通过对DEGs进行分析,发现火龙果在同一品种不同时期间的差异比同一时期不同品种间的更大。分别在R1 vs R3和W3 vs R3两组进行GO功能富集分析和KEGG代谢通路分析,通过GO分析发现,在分子功能上,有部分基因显著富集在蛋白与转录因子结合活动上;通过KEGG分析,大部分基因富集在次生代谢产物合成通路、氨基酸和核酸代谢通路、酪氨酸代谢通路上,其中酪氨酸是甜菜色素合成的前体。综上所述,红皮红肉火龙果发育过程中伴随着大量甜菜色素的合成,酪氨酸作为前体在其中起关键作用,且该色素的合成需要大量氨基酸、酶及转录因子的参与。甜菜色素合成途径中的分子调控机制尚未明确,通过本研究可以发掘火龙果中甜菜色素合成相关的关键基因,是开展后续实验的基础,为甜菜色素代谢途径的完善提供了有用的信息。     

大麦条纹叶片突变体的表型鉴定及转录组分析

叶色是与作物的光合速率及产量紧密相关的重要性状,利用叶色突变体研究叶绿体的发育过程及调控网络,有助于揭示叶色形成的机制。本研究在农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化过程中,获得一个具有条纹叶片的突变体(msal),该突变株具有条纹白化的叶片、茎秆,叶鞘、幼穗及幼种,其叶绿素和类胡萝卜素含量均下降。叶绿体超微结构观察显示条纹叶片突变体细胞的叶绿体数量变少,呈狭长型,结构不完整。转录组分析表明在突变体中有1004个差异基因,其中388个表达量下调,609个表达量上调。GO富集分析显示细胞组份"叶绿体"的富集频率最高,为23.0%,P值为5.74e^-07,表明"叶绿体"在转录水平上发生了改变。62个与叶绿体发育相关的差异基因在突变体中表达量均为上调,而与类胡萝卜素合成相关的差异基因表达量下调。我们推测该突变体抑制了类胡萝卜素的合成,影响了叶绿体发育,而作为补偿机制激活了叶绿体相关发育基因的表达。     

红肉猕猴桃果实发育期不同果肉部位比较转录组分析

红肉猕猴桃中果皮和内果皮在果实发育不同时期色泽变化模式有显著差异,但目前对于其内在的分子调控机制尚不清楚。本研究中,利用高通量测序技术,对红肉猕猴桃(‘红实2号’)中果皮与内果皮4个不同发育时期(开花后0 d, 28 d, 75 d, 157 d,分别标注为T1时期, T2时期, T3时期, T4时期)的样本进行转录组测序。经去除低质量数据后,得到Clean reads数目为2 192～4 331万,检测到的基因数目为24 607～29 170个。在(log2 Ratio)≥1和FDR<0.05阈值下,中果皮和内果皮在T2、T3、T4时期检测到的差异基因数目分别为1 880个、4 799个、7 346个和4 31个、1 493个、7 700个。KEGG分析显示这些差异表达基因被富集到68个代谢途径,包括DNA复制、RNA转运、蛋白质输出、植物激素信号转导、类黄酮生物合成、花青素合成、淀粉与蔗糖的代谢等。此外我们还鉴定到13个花青素合成相关基因差异表达,大部分基因的表达量随果实的发育呈现下降趋势,这一结果与花青素含量变化模式相吻合。本研究不仅深化了对猕猴桃果实成色差异机理的认识,还对今后的彩色猕猴桃选育种工作有一定的帮助。     

灵武长枣嫁接和根蘖繁殖植株果实转录组差异分析

为解析嫁接繁殖和根蘖繁殖灵武长枣果实糖和酸转化差异,本研究以两种繁殖方式的成熟期果实为材料,利用高通量测序平台Illumina/Nova-Seq 2500进行了转录组测序,对转录组数据质量评估获得两样品的序列长度分别为24.48 Gb (嫁接)和28.64 Gb (根蘖),错误率为0.03%,GC含量44.11%～44.56%,Q30大于90.54%,转录组数据与冬枣基因组序列比对,所有的转录组Reads均分布于冬枣12条染色体上,基因定位的Reads数量嫁接繁殖比根蘖繁殖多;差异表达基因分析筛选到27个显著差异表达基因,其中9个显著上调,18个显著下调;GO富集分析表明15个差异基因显著富集到GO的三大功能类别分子功能、细胞组分、生物过程中;KEGG富集分析表明10个差异表达基因显著富集到12条代谢通路中,其中包括3个上调基因和7个下调基因;进一步筛选到调控糖及有机酸代谢关键差异基因BAM1、PCO和HAOX1在淀粉和蔗糖代谢、牛胆素和亚牛磺酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢中显著表达,并在糖和有机酸的相互转化中起着关键调控作用。本研究表明嫁接繁殖和根蘖繁殖灵武长枣果实在糖和有机酸代谢存在差异,为灵武长枣优质果品繁育提供理论基础。     

DNA甲基化参与调控马铃薯响应干旱胁迫的关键基因挖掘

植物受到干旱胁迫时,会通过DNA甲基化做出快速反应以帮助其应对胁迫。为探究在干旱胁迫下,DNA甲基化是如何影响基因转录表达,本研究对甘露醇模拟干旱和5-azadC(去甲基化)处理下,抗旱性不同的2个马铃薯品种(抗旱型,青薯9号;干旱敏感型,大西洋)进行转录组学分析,以Fold-change>2和校正后P<0.01进行差异表达基因(DEG)的筛选。GO富集分析发现,2种处理都共同显著富集到氧化应激和碳水化合物代谢过程相关的GO term。说明不同耐旱性马铃薯在响应干旱胁迫时,与这些GO term相关的基因也受DNA去甲基化调控。对既响应干旱又响应DNA去甲基化的1345个DEG进行KEGG功能富集发现,与植物抗旱相关的通路有植物MAPK信号途径、植物激素信号转导途径、植物谷胱甘肽代谢通路、糖酵解与糖异生和磷酸肌醇代谢通路。说明这些通路相关基因在大西洋和青薯9号2个抗旱性不同的马铃薯品种中,响应干旱的敏感性受DNA甲基化调控。接着对DEG上游1500 bp启动子区域进行顺式作用原件和甲基化CpG岛分析发现,干旱胁迫下参与植物谷胱甘肽代谢的GST基因通过DNA去甲基化来降低启动子区ABRE和CAAT-box作用元件的甲基化水平,进而激活该基因的表达以应对干旱胁迫。因此,利用比较转录组学分析干旱和DNA去甲基化处理下的差异基因,可挖掘到DNA甲基化参与调控马铃薯响应干旱胁迫的相关基因,为研究马铃薯干旱胁迫响应的表观遗传学机理提供新的研究思路。     

花生籽仁不同发育时期的转录组测序分析

通过花生籽仁不同时期转录组测序分析,从分子水平上揭示控制花生油脂合成的重要基因。本研究以高油和低油花生新品系为研究对象,构建了花生籽仁早期和中后期4个转录组测序文库。通过高通量测序共获得了59 236条Unigenes,其COG功能涉及了大多数的生命活动,整体功能类的基因最多有4 730条;其中与代谢类和油脂转运相关的基因有654条;Unigene参与的花生代谢通路可分为126类,其中涉及生化代谢的Unigene数量最多,达到了7 672条,占整体的32.95%;有4大类代谢与油脂相关,分别是脂肪酸的生物合成,涉及的基因有85条;脂肪酸的生化代谢,涉及的基因有145条;不饱和脂肪酸的生物合成途径,涉及116条基因;亚麻酸的代谢途径,涉及有138条基因。对花生籽仁两个不同发育时期的差异表达基因进行分析,共得到了120多种代谢途径(passway);并且籽仁发育中后期基因的表达量大部分下调,说明花生种子发育初期,各类调控脂肪酸合成的基因比较活跃,而随着合成油脂调控的不断继续,相关调节基因表达量下降,同时各类脂肪酸和油脂的合成也渐渐变慢。研究结果为深入揭示花生籽仁发育过程中油脂合成调控的相关基因及其功能提供了丰富的数据资源。     

植物Dof转录因子的结构特点及功能研究进展

Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物中特有的转录因子,其N-末端具含保守锌指结构的Dof结构域,能够识别AAAG序列;Dof转录因子能够发挥多种功能,主要是由于其具有多变的C-末端,它是Dof蛋白的特异转录调控结构域。在植物中,Dof转录因子的功能主要与维管发育、叶片极性、保卫细胞特异基因的调控、碳氮代谢、种子发育和萌发、光响应及光周期调控的开花和花粉发育、次生代谢物合成、防御反应、生长素响应等生理过程有关。将这些进程归纳为组织分化、种子发育和代谢调节三个方面,通过对植物Dof转录因子的结构特点及功能进行分析,为Dof转录因子的深入研究提供参考。     

水稻无侧根突变体RM109及其野生型对照的转录组分析

侧根是水稻根系的重要组成部分,具有重要的意义。本研究通过Illumina Hiseq2000测序平台,对无侧根突变体RM109与其野生型对照根系进行转录组测序,进而比较分析差异表达基因,初步揭示影响水稻侧根发育的相关基因。结果表明无侧根突变体与野生型对照根系相比出现了2 327个差异基因,其中上调表达的有1 131个,下调表达的有1 196个,有36个基因表达差异倍数高达100倍以上(|log2Ratio|≥6.7)。通过Gene ontology (GO)数据库、KEGG pathway数据库比对分析注释差异表达基因的功能和参与的分子调控途径。GO分析结果表明被注释的差异基因划分成50个功能类别,KEGG分析共有352个显著差异基因可以详细注释到149条分类代谢途径中,共有36个表达差异基因富集于植物激素信号转导途径,36个差异表达基因中有2个是与植物根系生长发育相关的Aux/IAA基因,6个植物生长素响应SAUR基因。本研究为进一步为水稻侧根发育分子机理研究提供基础,为水稻根系育种提供理论参考。     

基于转录组测序枣胚发育过程差异表达基因分析

为了探索枣胚发育的分子机理,本研究使用Illumina高通量测序平台对中度可育枣品种‘冷白玉’四个发育时期(原胚,小球形胚,心形胚,鱼雷形胚)的幼胚进行转录组测序,共获得135 743 080条高质量Reads,Q3092.88%。样品间共筛选出2 333个差异表达基因,其中有19个差异表达基因是所有样品组合共有的。原胚与小球形胚的幼胚(L2 vs L3)间的差异表达基因(differentially expressed gene, DEG)基因数(867)明显多于其他组合,小球形胚与鱼雷形胚(L3 vs L5)间的DEG基因数(503)明显多于原胚与心形胚(L2 vs L4)间的DEG基因数(498)。GO富集分析显示,四个发育时期的DEG主要共同富集到分子功能、细胞组分、生物过程等GO条目。KEGG富集分析发现,四个时期的DEGs主要共同富集到次生代谢合成、代谢过程、植物信号转导通路,主要参与了苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、氰氨基酸代谢、光合作用-天线蛋白质等代谢途径。通过转录组测序分析了不同发育阶段的‘冷白玉’枣幼胚差异基因表达状况,为寻找枣胚发育的相关基因提供理论参考。