Napin启动子特异性表达油菜BnGPAT9基因

甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)基因编码参与植物油脂生物合成的酶。为了提高油菜籽含油量,促进油菜增产增油,改善菜籽油脂肪酸组分,克隆甘蓝型油菜Napin启动子与三酰甘油合成相关基因BnGPAT9,构建pBI121-Napin-BnGPAT9植物过表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥,采用气相色谱法分析种子中脂肪酸组分,通过索式抽提法测定种子中油脂含量,研究在种子中过表达BnGPAT9基因对种子油脂合成的影响。Napin启动子在线分析表明,克隆到的启动子具有大量TATA-box、CAAT-box以及ABRE、GCN4等特征元件,完全具备种子特异性表达功能;种子中脂肪酸组分分析显示,拟南芥种子中油酸(C18∶1)含量提高0.70～1.01百分点,亚油酸(C18∶2)和芥酸(C22∶1)含量降低;拟南芥种子含油量测定结果显示,种子中含油量显著增加1.91～2.56百分点。综上,甘蓝型油菜BnGPAT9基因对植物油脂合成具有重要作用,利用Napin启动子在拟南芥种子中过表达BnGPAT9基因可提高种子含油量并改善脂肪酸组成成分,为BnGPAT9基因应用于油菜油脂改良方面打下一定基础。     

拟南芥长链脂肪酰辅酶A合成酶基因(LACS1)的克隆及功能分析

长链脂肪酰辅酶A合成酶(LACS,EC6.2.1)催化脂肪酸生成脂肪酰辅酶A,进入脂肪酸的β-氧化途径。本课题从拟南芥中克隆了LACS家族成员At LACS1,构建表达载体,通过Li Ac转化法转入酵母表达系统中表达,气质色谱(GC-MS)检测酵母细胞中脂肪酸组成。结果表明,拟南芥LACS1基因全长为1 983 bp,编码一个含660个氨基酸的多肽。以含空载酵母细胞中脂肪酸组成为对照,过表达LACS1的酵母细胞中棕榈一烯酸(16:1)相对含量显著增加,硬脂酸(18:0)的相对含量显著减少。这些结果提示,At LACS1对脂肪酸代谢有一定的影响,能够活化游离的长链脂肪酸,尤其偏好C16和C18底物。     

甘蓝型油菜皖油20号种子不同部位油脂合成的转录调控分析

甘蓝型油菜是主要的油料作物之一,种子含油量一般在35%～50%。油脂主要储存于油菜种子胚中,胚主要由子叶[包括外子叶(OC)和内子叶(IC)和胚轴(EA)]组成。低芥酸油菜品种皖油20号(WY20)种子不同部位的含油量存在显著差异。WY20的胚中, OC含油量最高, EA含油量最低。同时,脂肪酸组成在种子不同部位也存在差异, EA中棕榈酸(C16:0)、亚油酸(C18:2)及二十碳酸(C20:0)的比例均显著高于子叶,特别是C16:0在EA中的比例约为子叶的2倍。而油酸(C18:1)及二十碳烯酸(C20:1)在子叶中的比例均显著高于EA。硬脂酸(C18:0)在OC中含量最低,在IC和EA中无差别。亚麻酸(C18:3)则在OC中含量最高,在IC和EA中无差异。对发育34d种子的IC、OC和EA进行转录组分析,将三个部位中基因表达定量分析的结果两两比较后共发掘出7192个差异表达基因,其中OC和IC之间差异表达基因数目较少,子叶和EA间有较多的差异表达基因。子叶和胚轴中的差异表达基因富集在光合作用、脂肪酸代谢和叶绿素合成等生物学过程。基因功能注释显示,差异表达基因中有355个和脂质代谢相关,且多集中在质体中脂肪酸从头合成途径。本研究表明油脂合成途径关键基因的差异调控是造成油菜种子不同部位含油量和脂肪酸组成差异的主要因素。     

甘蓝型油菜2个GPAT6同源基因的克隆与表达分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT)是三酰甘油生物合成的关键酶,催化三酰甘油合成的起始步骤,在植物中参与调节生长发育、脂质的合成和逆境应答等过程。本试验通过RT-PCR从甘蓝型油菜品种湘油15中克隆得到GPAT6基因的2个拷贝,分别命名为BnGPAT6-1(GenBank登录号为KJ000117)和BnGPAT6-2(KC106728)。它们的编码区序列(coding DNA sequence,CDS)均为1506 bp,编码501个氨基酸。预测其蛋白结构N端含有一个类卤酸脱卤酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase,HAD-like)活性结构域,C端含有一个溶血磷脂酰基转移酶(lysophospholipid acyltransferase,LPLAT)功能域。蛋白序列比对和进化树分析表明,甘蓝型油菜与白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和琴叶拟南芥(A.lyrata)中的GPAT6序列相似性最高。组织表达结果表明BnGPAT6基因在花中的表达量最高,在未成熟的胚中表达量呈先升高后降低的趋势。BnGPAT6的表达受ABA的抑制;在干旱和6-BA胁迫下几乎同时升高;在盐胁迫下,短时间内升高,达到峰值后降低;在水渍条件下没有明显变化。     

拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

油葵HaDGAT2基因的功能及表达特性分析

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)在植物油脂合成中起关键作用,其活性高低与植物含油量显著相关。为探明油葵二酰甘油酰基转移酶2基因(HaDGAT2)的功能,本研究以‘新葵杂5号’为试验材料,从油葵中扩增HaDGAT2基因序列并构建酵母穿梭表达载体pYES2-Ha DGAT2,将重组载体转入酿酒酵母INVSc1后提取酵母总脂肪酸,甲酯化后GC-MS分析。结果显示,在酿酒酵母中可成功诱导HaDGAT2基因,且转HaDGAT2基因酵母中棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)含量与对照相比得到提高。结果表明,HaDGAT2基因在调控油脂合成的过程中具有重要作用。实时荧光定量PCR分析结果表明HaDGAT2基因在油葵根、茎、叶、花、子叶和不同发育时期的种子中都有表达,且在开花后31天的种子中表达量高,说明该基因表达无组织特异性,在油葵种子油脂积累后期起关键调控作用。本研究为深入了解油葵油脂和调控机制提供了基础,为今后利用分子育种手段提高并改良葵花籽油的品质提供了理论基础。     

拟南芥抗病相关基因T1N6_22的原核表达分析

为构建拟南芥抗病相关T1N6_22基因的原核表达载体并进行高效表达,获得纯化的T1N6_22蛋白,以拟南芥Col-0的c DNA为模板,扩增获得了T1N6_22基因CDS,对其进行克隆、测序后与含有GST标签蛋白的p GEX4T-1载体相连,构建T1N6_22的原核表达载体p GEX4T-1-T1N6_22-GST。经酶切和测序鉴定正确后,将构建好的载体及空载体转化大肠杆菌BL21。结果表明,在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与标签蛋白融合的T1N6_22蛋白,大小约57 k Da。SDS-PAGE分析表明,高效表达的诱导条件为0.1 mmol/L IPTG诱导培养3 h。研究结果为进一步T1N6_22互作蛋白的筛选及其调控拟南芥抗病分子机制的研究奠定了基础。     

利用酵母单杂交筛选拟南芥AtSTK基因表达调控蛋白的研究

拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。为进一步研究AtSTK基因表达的调控机制,以拟南芥基因组DNA为模板设计引物,扩增获得AtSTK基因的启动子序列,并构建到报告载体pAbAi,将重组报告载体质粒pAbAi-HYT利用BstbⅠ进行单酶切线性化,转化酵母菌株Y1H Gold,线性化的pAbAi-HYT整合到基因组中。然后,将纯化的拟南芥双链cDNA、pGADT7-Rec载体共转化含有报告载体pAbAi-HYT的酵母菌,将菌液涂布到含有100 ng/m L Ab A的SD/-Leu培养基上进行阳性克隆的酵母单杂交筛选。通过回复鉴定、序列测定,最终筛选获得了可能参与AtSTK基因表达调控的4个拟南芥基因。测序结果表明,酵母单杂交筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域,为WRKY类转录因子的一员。因此,AtSTK基因的表达很可能接受MAPK信号传导途径中AT3G32090基因编码的WRKY类转录因子的调控,从而影响拟南芥植株的耐盐性。     

花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及反义表达载体的构建

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制植物籽粒中蛋白质/油脂含量比例的关键酶.本研究利用RT-PCR技术,克隆PEPCase基因的片段,并将克隆的PEPCase基因片段反向连接替代植物表达载体PBI121的GUS基因.从花生栽培品种荔蒲大花生基因组中克隆获得编码PEPCase的基因片段(886 bp),其核苷酸序列与已报道的花生(EU391629)、棉花(AY008939)、大豆(D10717)、拟南芥(AY210895)、豌豆(D64037)PEPCase基因对应部分的同源性分别为99.77%,84.37%,81.54%,81.25%,78.71%,说明我们得到PEPCase基因片段较准确.构建的反义表达载体中PEPCase基因由35S启动子所控制,将构建的反义表达载体命名为pBGPEP.为通过反义抑制技术提高花生含油量提供了基因及表达载体.     

拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定

芥子酶是一类水解硫代葡萄糖苷的酶,广泛存在于十字花科植物中。人们在拟南芥中已经发现了3个芥子酶基因,分别是TGG1、TGG2和TGG3。通过对拟南芥基因组数据库的搜索,发现3个新的芥子酶基因TGG4、TGG5和TGG6。本研究克隆了TGG4基因全长cDNA序列,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115,进行甲醇诱导表达,重组蛋白用离子交换层析柱纯化。纯化的重组蛋白经测定具有芥子酶活性,而且其活性被低浓度的维生素C激活,具有芥子酶的典型特征。芥子酶系统发生树分析进一步表明,TGG4代表一个芥子酶基因新亚家族。     

紫苏二酰基甘油酰基转移酶2基因克隆与功能研究

二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)是植物合成三酰甘油(TAG)最后一步的关键酶,其中DGAT2在某些植物的种子油中能选择性积累更多不饱和脂肪酸。本文成功克隆了紫苏二酰基甘油酰基转移酶2基因(PfDGAT2),并进行生物信息学分析。PfDGAT2实时荧光定量结果表明,不同器官中PfDGAT2基因均有表达, 10 d种子的表达量最高,在根中的表达量次之,在种子发育中后期,PfDGAT2表达量逐渐降低。与野生型拟南芥相比,过表达PfDGAT2拟南芥种子含油率提高了21.68%～77.89%,其中种子含油率增加最多的4个株系,其亚麻酸(C18:3)增加4.57%,花生一烯酸(C20:1)增加7.44%,花生二烯酸(C20:2)增加5.4%,二十二一烯酸(C22:1)增加10.37%,而棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和亚油酸(C18:2)含量分别降低了3.47%、6.64%和4.83%,油酸(C18:1)和花生酸(C20:0)分别只降低了0.18%和1.91%。本研究结果表明,紫苏PfDGAT2基因不仅能提高种子含油率,还能促进亚麻酸、花生一烯酸等不饱和脂肪酸的积累,这为研究植物不饱和脂肪酸的合成积累提供了参考及理论依据。     

碱茅Put-HVA1基因的克隆及在酵母和拟南芥中的表达

本研究从碱茅(Puccinellia tenuiflora)cDNA文库中分离得到Put-HVA1基因,其开放读码框(ORF)长534bp,共编码177个氨基酸,其预测分子量约为18.167kD,理论等电点约为7.80。氨基酸序列比较结果表明,Put-HVA1氨基酸序列与水稻、玉米的HVA1蛋白氨基酸序列的同源性分别为69%和56%。另外,将Put-HVA1基因构建到酵母表达载体pYES2和植物双元表达载体pBI121上,并分别转化至酵母(INVSc1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。对pYES2-Put-HVA1转化酵母进行盐碱、氧化胁迫、渗透胁迫及干旱处理,结果表明:重组酵母提高了对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力。对部分转基因株系进行了抗盐性试验,表明转Put-HVA1基因拟南芥在150mmol/L NaCl和5mmol/L NaHCO3胁迫下长势优于野生型拟南芥,表现出一定的耐受性。     

SeNHX1与GFP融合基因在酵母中表达及其耐盐性表现

通过构建盐角草的液泡型Na /H 反向转运蛋白SeNHX1基因的酵母表达载体,研究该基因对酵母耐盐性的影响.将SeNHX1基凶与荧光报告基因GFP融合,分别构建酵母表达载体pYES2.SeNHX1-GFP、pYES2-SeNHX1和pYES2-GFP,转化酵母W303,诱导3个载体表达,并测定含有不同表达载体的酵母生长曲线.结果表明.荧光显微镜下观察到带有报告基因GFP的2个转化子W303(pYES2-SeNHX1-GFP)和W303(pYES2-GFP)均可发出绿色荧光,而没有报告基因的转化了W303(pYES2-SeNHX1)不发出荧光;在含有0.8 mol/L NaCl培养基中培养0～48 h内,W303(pYES2-SeNHX1-GFP)和W303(pYES2-SeNHX1)菌株前期生长比对照菌株W303(pYES2-GFP)慢,但在培养48 h后则大大超过对照菌株.表明所构建带有目的基因SeNHX1的酵母表达载体已表达,且证实SeNHXl基因可提高酵母的耐盐性.     

玉米叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测

Tps1是生物保护物质海藻糖的关键合酶基因.构建含Tps1的玉米叶绿体表达载体,首定从玉米叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段;然后将编码酵母海藻糖合酶基因Tps1表达盒(Prrn-Tps1-TpsbA-ter)、草丁膦抗性基因Bar表达盒(RpsbApro-Bar-RpsbAter)、卡那霉素抗性基因Npt Ⅱ和绿色荧光蛋白基因Gfp构建的融和基因表达盒(Prrn-Npt Ⅱ/Gfp-RrbcLter)一起克隆到定点整合同源片段之间,构建了玉米叶绿体的稳定表达载体mTKGB.通过基因枪轰击法将mTKGB转化到玉米幼嫩叶片中,培养2 d后,在激光扫描共聚焦显微镜下脱测到玉米一些细胞的叶绿体中有很强的GFP绿色荧光,结果表明构建的载体可在玉米叶绿体中表达.     

一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析

通过陆地棉高品质纤维种质系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序,得到一个开放阅读框(open reading frame,ORF)完整的棉纤维表达蛋白(GhCFE,GenBank登录号:DQ073045)cDNA序列。该cDNA序列全长1274bp,最大的ORF为996bp,编码332个氨基酸,其理论上的等电点pI=6.14,分子量Mw=37.7KD。它的N-末端存在一个长度为27个氨基酸残基的信号肽。RT-PCR分析表明,该基因在根、茎中不表达,在叶片中微弱表达,在不同发育时期的纤维细胞中均表达,且在纤维伸长期表达量最高。进化树显示GhCFE与已报导的3个棉纤维表达蛋白cDNA有很高的同源性。通过构建酵母表达载体,发现该基因对酵母细胞的伸长和细胞壁加厚没有显著影响。利用pBI121质粒构建了含35S启动子的正义表达载体和含棉纤维特异表达启动子E6的正义和反义表达载体,正在通过农杆菌介导的遗传转化,开展该基因的功能验证。     

哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系orf160的克隆及遗传转化

以哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系及其保持系、恢复系为材料,克隆并测序线粒体功能基因的侧翼序列。通过生物信息学分析,在atp4下游发现一个哈克尼西棉细胞质不育系特有的orf160。orf160全长480 bp,N端与atp6序列部分同源,C端序列与核序列部分同源;编码的159个氨基酸序列,与膜蛋白、细胞周期蛋白具有部分同源性。以含有线粒体导肽的GFP瞬时表达载体转化后,在洋葱表皮的细胞膜上观察到绿色荧光,表明线粒体定向载体正常表达。构建酵母和植物表达载体,分别转化酵母、烟草和拟南芥;同对照相比,转基因酵母菌斑畸形且生长缓慢;转基因拟南芥和烟草种子大部分畸形,T₁和T₂代植株的结实率和种子发芽率降低,花粉着色比野生型浅。结果表明,orf160基因的表达影响受体正常发育。     

含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

拟南芥抗病相关基因T1N6-22互作蛋白的酵母双杂交鉴定

利用酵母双杂交技术,鉴定拟南芥抗病相关基因T1N6-22的互作蛋白,为进一步明确T1N6-22基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。利用Gateway技术,构建T1N6-22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体AD-T1N6-22、AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480、BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480。将空载的AD载体分别与BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合共同转化酵母感受态细胞,检测各基因的自激活活性,发现T1N6-22、AT1G21400、AT2G19480基因无自激活活性,AT1G06050基因有自激活活性。将AD-T1N6-22载体分别与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合,BD-T1N6-22载体分别与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480载体组合,进行酵母双杂交试验。结果发现,AD-T1N6-22与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480,BD-T1N6-22与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480共转化的酵母细胞在二缺(-Leu/-Trp)、三缺(-Leu/-Trp/-His)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)培养基上均可以生长,表明T1N6-22与AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480在酵母细胞中直接互作。     

陆地棉GhCRE1影响种子萌发初探

为明确陆地棉细胞分裂素受体基因(GhCRE1)在调控植物生长发育中的功能,为研究陆地棉GhCRE1基因调控种子萌发的分子机理提供材料,进一步从分子水平上提高种子萌发率,通过克隆陆地棉GhCRE1基因,利用基因过表达技术将该克隆片段连接至含Ubiquitin启动子的pCUbi1390载体上构建该基因的过表达载体,同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计拟南芥CRE1基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,从而构建拟南芥CRE1基因靶向敲除载体。将以上2种载体转化农杆菌,使用花序浸染法,以拟南芥为受体材料创建GhCRE1过表达株系及基因编辑功能缺失突变体。接着利用PCR技术和qPCR技术筛选鉴定获得过量表达的GhCRE1拟南芥株系及CRE1功能缺失的拟南芥株系并收获种子,经过对比统计收获的种子与野生型种子在1/2MS培养基上的萌发势进行表型分析,进一步明确陆地棉GhCRE1基因影响种子萌发的功能。结果显示,本研究成功获得了拟南芥GhCRE1过表达株系及CRISPR基因编辑功能缺失突变体株系,且通过数据整理后发现,在种子萌发第2天时,相比野生型,2个过表达转基因株系萌发势分别提...