木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

木薯MYB转录因子基因MeMYB60表达特征分析及其互作蛋白筛选

Myeloblastosis (MYB)类转录因子在植物对非生物胁迫的响应过程中起重要调控作用。本研究在分析栽培木薯MYB家族成员表达模式的基础上,筛选并克隆到了一个R2R3-MYB转录因子基因MeMYB60。基因表达特性分析表明,该基因在叶片特异表达,受干旱、低温负调控,同时对ABA处理也有响应。启动子活性分析发现,MeMYB60可以在保卫细胞表达,预示着该转录因子基因的表达可能与木薯气孔开闭调节有关。MeMYB60编码蛋白主要定位于细胞核中,具有转录激活活性,其转录激活结构域在蛋白C端第194～343氨基酸残基范围内。以MeMYB60蛋白N端第1～194氨基酸残基片段为诱饵,从干旱胁迫后木薯叶片的cDNA文库中筛选到18种可能与MeMYB60互作的蛋白,酵母双杂确定了MeCatlase1和MeCatalase2分别与MeMYB60存在互作关系。本研究为深入研究转录因子MeMYB60在木薯响应非生物胁迫过程中的功能并解析其调控网络奠定了基础。     

转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的研究进展

转录因子是一类调节基因表达的重要调控蛋白,转录因子和与其结合的启动子中的相关顺式作用元件,在基因表达方面起着分子开关的作用,因此探究转录因子与启动子的相互作用尤为重要。为了研究在植物遭受逆境胁迫时,转录因子对下游靶基因的调控机制,本文综述了参与逆境胁迫的主要转录因子家族、转录因子的转录激活活性鉴定、转录因子和启动子互作分析技术及其在植物应答逆境胁迫中的应用,为全面、深入研究植物应答逆境胁迫时的基因表达调控机制提供参考。     

参薯DELLA基因家族鉴定及分析

DELLA基因家族是参与赤霉素信号调节过程的负调控因子,DELLA常与其他转录因子结合,通过影响这些转录因子起作用。为了解析参薯中DELLA基因家族的调控网络,本研究对参薯DELLA基因家族进行鉴定,对其理化性质、系统进化树、保守基序、亚细胞定位预测,赤霉素处理后基因转录谱、互作转录因子进行分析。研究发现,参薯DELLA基因家族包含4个家族成员,都为酸性蛋白。系统进化树分析发现DaDELLA2与拟南DELLA基因处于同一分支,保守基序分析发现除DaDELLA4外,都含有10个蛋白保守序列,DaDELLA定位主要分布在细胞质和细胞核中。根据转录谱发现,赤霉素处理15 d和60 d后,转录因子DaAP2.7-LG16在块茎中表达量最高。分子实验表明DaDELLA2自激活发生在DELLA蛋白N端,与DaAP2.7-LG16存在互作,且互作用主要发生在DELLA蛋白的N端。以上研究对参薯DELLA蛋白基因家族进行初步分析,为进一步的研究提供基础。     

大豆14-3-3蛋白与转录因子蛋白GmMYB173的互作

14-3-3蛋白家族在真核生物中普遍存在,可与其他蛋白相互作用,调控多种生理生化过程。MYB基因家族作为植物中最大的一类转录因子,广泛参与了植物的生长发育和代谢调控。本研究通过分析1个从自贡冬豆中克隆的MYB转录因子GmMYB173的亚细胞定位情况,发现GmMYB173在细胞核中特异表达;序列分析发现GmMYB173与GmMYB176相似,具有1个14-3-3蛋白的潜在结合结构域,即pST结合结构域。通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)删除了GmMYB173序列中pST结合结构域编码序列,发现GmMYB173细胞核表达特异性消失。酵母双杂交互作分析表明,大豆基因组中所有具有表达的16个14-3-3蛋白GmSGF14a~GmSGF14p均能与GmMYB173互作。β-半乳糖苷酶活性分析发现,与GmMYB173互作最强的是GmSGF14n,GmSGF14k、GmSGF14e和GmSGF14o其次。这些结果说明14-3-3蛋白不仅与GmMYB173互作,且可能调控其在细胞内的定位,有助于研究14-3-3蛋白与GmMYB173的互作关系及其在大豆生长发育中的作用。     

枣ZjERF53转录因子的转录激活分析及互作蛋白筛选

乙烯应答因子广泛参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应过程。本研究克隆了1个在枣(Ziziphus jujuba Mill.)果实成熟后期高表达的ZjERF53转录因子,对其进行了亚细胞定位、转录激活活性和互作蛋白筛选研究,以揭示其生物学功能。研究结果表明：ZjERF53基因编码区序列全长为1 155 bp,能在细胞核和细胞膜中表达;ZjERF53具有自激活活性,其转录激活功能区域位于蛋白序列C端;以无自激活活性pGBKT7-ZjERF53-N为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选枣果实cDNA文库,共获得4个互作蛋白。本研究揭示了ZjERF53可能参与枣树抗病和抗旱等非生物胁迫响应,为解析ERF参与调控枣树生物学过程的分子机制提供了工作基础。     

菜心Dof基因克隆、生物信息学分析及表达分析

Dof (DNA binding with one finger)是植物特有的转录因子,在调控植物生长发育和代谢过程中发挥着重要作用。为明确Dof具体的生物学功能,本研究以‘油绿501’菜心为材料,采用同源克隆法获得了Dof全长序列,并对其编码蛋白结构、基因表达模式及其互作蛋白的调控网络进行分析。结果表明：菜心BcDof3;1基因全长624 bp,编码207个氨基酸,其N-端含有保守的Dof锌指结构。系统进化树分析表明,BcDof3;1与白菜BrDof3;1和拟南芥AtDof2的同源关系较近。RT-qPCR结果表明,BcDof3;1在菜心根、茎、叶、花和种子中均有表达,尤其在叶和花中的表达水平最高;其表达水平受氮调控。互作蛋白网络分析表明,BcDof3;1可能通过中性转化酶、淀粉酶、酰胺酶等调控碳氮代谢。研究结果为深入研究Dof在菜心生长发育和碳氮代谢中提供了理论参考。     

日本结缕草ZjERF2转录激活验证及互作蛋白的初步筛选

为了研究ZjERF2转录因子在日本结缕草(Zoysia japonica)生长发育和环境胁迫中的调控通路,筛选与ZjERF2转录调控过程中互作的蛋白。本研究采用酵母双杂的方法,通过构建"诱饵"载体p GBKT7-ZjERF2,并转化酵母感受态细胞,表明"诱饵"载体在酵母细胞中无毒且不能自激活。将p GBKT7-ZjERF2和日本结缕草全长cDNA文库共转化酵母感受态细胞,经SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选获得29个菌落,通过PCR扩增获得23个条带,进一步筛选到18个与ZjERF2互作的候选蛋白。对候选蛋白进行生物信息学分析,初步筛选到5个参与植物的生长发育、抗病原菌及环境胁迫调节的互作蛋白。本研究为探索Zj ERF2在植物生长发育和环境胁迫应答的调控机制提供帮助。     

大豆转录因子基因GmDof3的克隆及非生物胁迫诱导表达分析

植物Dof (DNA binding with one finger)转录因子在植物应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。为了探索大豆Dof转录因子与非生物胁迫的关系,本研究利用RT-PCR技术克隆了一个大豆中Dof转录因子基因GmDof3。GmDof3编码含有483个氨基酸残基的蛋白质,分子量为52.91 kD,等电点为8.11。蛋白结构预测发现,该蛋白含有一个典型Dof结合域,定位于细胞核中且含有大量磷酸化位点。进化分析表明大豆GmDof3蛋白与木豆CcDof3蛋白的同源性最高。顺式作用元件预测结果显示,GmDof3启动子序列中含多种逆境响应元件。实时荧光定量PCR表明,高盐、干旱、低温和高温均可诱导GmDof3的表达。本研究结果可以为大豆Dof转录因子在植物抗逆基因工程中的应用提供理论依据。     

桃叶片低温响应转录组分析

抗寒是桃育种工作重要的目标性状,受多个基因的调控,转录组测序是对特定生理条件下的转录本进行测序分析,用以深入探究桃叶片低温响应的分子机制。以熊岳巨桃的叶片为试验材料对4℃低温(LT)处理下和正常叶片(RT)进行转录组测序分析。利用DESeq2进行差异表达分析,获得72个上调差异表达基因和3个下调表达基因。KEGG代谢通路分析差异表达基因的代谢通路,并进行蛋白的互作预测。结果显示,低温处理的叶片呈现卷曲、变黄和失水的生理状态,差异代谢基因主要富集在植物病原体互作、MAPK信号通路和次生物质代谢积累等途径。MYC2、SPCH和Pti4～6转录因子可能在响应冷胁迫中调节低温带来的伤害中起到重要作用,MYC2和CBF蛋白预测相互作用,且分别与多个蛋白互作。本研究表明,有多个代谢途径共同响应桃叶片的低温胁迫,还预测到了可能在冷反应调节途径中起到关键作用的相关转录因子,为探究桃响应冷胁迫的分子机制打下基础。     

牡丹PsDREB转录因子基因的克隆及亚细胞定位

DREB转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白,它在植物对干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着非常重要的调控作用。本研究以芍药科芍药属牡丹‘洛阳红’品种叶片提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个1 661 bp的DREB(dehydration responsive element binding protein)基因的cDNA序列,包含1 089 bp的开放阅读框、448 bp的5'非编码序列和124 bp的3'非编码序列,命名为PsDREB。该基因的cDNA编码363个氨基酸,与葡萄、梧桐、杨树和咖啡的同源性分别为61%、60%、56%和55%。为进一步验证其功能,本研究通过基因枪法对该基因编码的蛋白进行了亚细胞定位检测,结果发现该蛋白定位于细胞核,符合转录因子细胞核定位的特征。研究结果为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

陆地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

【目的】克隆了1个在棉纤维发育次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)转录因子基因Gh MYB52(Gh_A12G2460)。本研究旨在分析该MYB转录因子在陆地棉纤维次生壁发育过程中的作用。【方法】通过一步克隆法,从陆地棉遗传标准系TM-1中克隆了1个在纤维次生壁加厚期优势表达的R2R3类MYB转录因子基因Gh_A12G2460,进化树分析结果表明Gh_A12G2460与拟南芥中AtMYB52基因的相似度最高,因此将其命名为Gh MYB52。通过进化树构建、氨基酸序列多重比对、定量聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、烟草瞬时转化、酵母双杂交等对其基因结构、编码产物的结构、表达特征、亚细胞定位以及互作蛋白进行了分析。【结果】GhMYB52基因的开放阅读框长672 bp,编码223个氨基酸残基,预测蛋白的相对分子质量为26.06 kDa,等电点为9.83。qRT-PCR结果表明,Gh MYB52基因在开花后15～25 d的棉纤维中优势表达。亚细胞定位结果显示,GhMYB52蛋白定位于细胞核,符合转录因子的特征。酵母转化结果显示,GhMYB52蛋白具有强烈的转录激活活性,并且与1个NAC类转录因子GhFSN1有强烈互作。【结论】GhMYB52是1个在棉花纤维次生壁加厚时期优势表达的R2R3类MYB转录因子,它可能通过与NAC类转录因子互作,形成蛋白复合物参与棉花纤维次生壁加厚过程。本研究为进一步从分子水平上验证GhMYB52基因在棉花纤维发育过程中的生物学功能奠定了基础。     

GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性分析

TCP转录因子是参与植物生长发育的特异性家族蛋白,但是棉花TCP转录因子家族中的大多数成员功能尚不清楚。为了定位GbTCP5转录因子调控的靶基因,本研究通过Plant CARE在线网站分析棉花纤维发育基因GbGL3上游3 000 bp启动子中的顺式作用元件,构建含有TCP顺式作用元件的载体PHISII-GbGL3和酵母表达载体p GADT7-GbTCP5,通过酵母单杂交分析GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性。结果表明：GbGL3上游3 000 bp启动子中包含TCP顺式用作元件和功能各异的顺式作用元件,酵母单杂交实验结果表明GbTCP5能够与GbGL3启动子中含有的TCP顺式用作元件结合。本研究为进一步了解GbTCP5转录因子的功能提供依据。     

桑树PHR家族基因的鉴定及生物信息学分析

磷是植物生长发育的主要矿质营养元素之一,磷饥饿响应(phosphate starvation response, PHR)基因在调节植物磷素吸收中起着重要作用。鉴定桑树磷饥饿响应转录因子家族成员,分析其生物信息学特征,为桑树PHR家族基因的功能研究提供基础。从桑树基因组数据库中获得桑树PHR转录因子序列,利用GSDS、ExPASy、MEGA、MEME、psRNATarget、STRING等软件和网上转录组数据,对桑树PHR家族成员的基因结构、蛋白理化性质、保守基序、系统进化、基因组织表达、调控miRNA和蛋白互作网络进行分析。从桑树基因组中共鉴定出12个PHR基因家族成员,氨基酸数介于256～1 529之间,83.3%的成员属于酸性蛋白,所有成员均为亲水性蛋白。进化分析显示,MnPHR转录因子归为9个聚类组,各聚类组含有1～2个MnPHR成员。外显子数为6、7、8、19的MnPHR编码基因成员分别有7个、3个、1个、1个,同一聚类组中的基因结构类似。发现4个保守性较强的基序,所有MnPHR转录因子均含有基序1～4,聚类组Ⅰ～Ⅳ的MnPHR转录因子缺少基序6。基因组织表达分析发现10个桑树PHR基因在不同组织中有表达,且存在组织特异性,部分基因转录可能受miRNA的调控。MnPHR1的蛋白互作网络分析发现,其主要参与了纤维素合成和转录因子表达调控等生物学过程。桑树PHR家族基因结构和氨基酸序列具有较强的保守性,其组织表达和蛋白互作网络结果表明该家族基因在植物的生长发育和营养吸收过程中发挥作用。本研究结果为深入开展桑树磷吸收和转运相关基因的克隆和功能验证提供了基础。     

生长素响应因子ARF研究进展

生长素响应因子ARF是一类新的转录因子,能够特异性结合生长素初期响应基因启动子中的Aux RE的TGTCTC序列,对生长素响应基因的表达起到激活或抑制作用。近年来,其信号转导途径的互作、激素信号途径以及受micro RNA调控机制等多方面研究得到了深入开展。本综述参考国内外有关研究,详细分析了ARF蛋白结构,探讨了其在生长素信号途径中的作用机制,总结了其在植物体内的主要功能研究,尤其是在植物花器官和叶片生长发育过程中的重要作用,为利用分子生物学手段对植物生长的调控提供参考。     

大麦GRF家族的基因组鉴定及生物信息学分析

生长调控因子(grow regulating factor, GRF)是重要的植物转录因子之一,在调控植物生长发育过程中发挥重要作用.本研究通过生物信息学分析,从大麦基因组中鉴定出12个HvGRF转录因子家族成员,且均具有完整的特征结构域QLQ和WRC.HvGRF家族成员含有2～5个外显子,蛋白二级结构具有相似的特征,...     

红掌响应细菌性叶疫病的转录因子基因AanWRKY1的鉴定

WRKY家族转录因子参与植物各种生物胁迫和非生物胁迫反应,同时也参与形态建成、物质代谢、种子休眠、衰老等过程。本研究在前期红掌疫病诱导转录组数据中筛选到一个WRKY家族基因,RT-PCR扩增到1 658 bp全长cDNA,包含一个1 035 bp的开放阅读框,生物信息学分析预测此基因是一个典型的WRKY转录因子,命名为Aan WRKY1(NCBI No.KY597634)。qRT-PCR证实该基因叶片中受疫病侵染上调表达,同时能够被SA、JA、ABA、ETH、GA等激素信号分子诱导,非处理条件下在花梗和茎中表达量最高。通过农杆菌介导洋葱表皮侵染法,瞬时表达AanWRKY1-eGFP,显示该基因编码蛋白定位于细胞核,进一步酵母单杂交实验,证明该基因具有离体转录激活活性。研究结果表明红掌AanWRKY1基因能够响应细菌性疫病及其他胁迫反应,具有应激转录调控的作用,该基因的鉴定为进一步解析其分子病理学作用机理提供依据。     

木薯SWEET1基因的分子克隆、亚细胞定位与功能分析

SWEET基因家族为新发现的一类糖转运蛋白家族,具有转运蔗糖及单糖的功能,在真核生物中广泛存在,其特点为具有1~2个MtN3_slv结构域及7个跨膜结构域,对植物生长发育、生理代谢及植物-病原菌互作等方面具有重要的调控作用。为了探索热带作物木薯中SWEET基因的功能,本研究采用RT-PCR技术,从木薯Ku50成熟叶片中克隆得到MeSWEET1基因的编码序列,并对其进行了生物信息学预测分析和功能初步研究。本研究结果表明:MeSWEET1蛋白含有植物SWEET家族两个保守的MtN3_Slv功能域,还具有7个跨膜结构域。系统进化树分析显示,MeSWEET1与拟南芥AtSWEET1、水稻OsSWEET1a和OsSWEET1b亲缘关系最近,属于SWEET蛋白家族进化树的Clade I分枝class II小家族。亚细胞定位结果表明,MeSWEET1蛋白定位于细胞膜上。组织特异性表达分析揭示,MeSWEET1在木薯成熟叶片中相对表达量最高,而在新叶和果实中相对表达量最低。本研究的结果将为进一步研究木薯MeSWEET1基因在糖转运及与病原互作等方面的功能奠定了初步的理论基础。