研究土壤微生物多样性的PCR条件优化(英文)

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

研究土壤微生物多样性的PCR条件优化

[目的]对PCR-DGGE法的试验条件进行优化,以更好地分析土壤微生物遗传多样性。[方法]改良高盐法提取土壤DNA,改进引物设计,改变PCR反应过程中退火温度、扩增体系,比较PCR扩增结果。[结果]经过改良的高盐法提取的土壤微生物DNA效果更好。PCR扩增选择20μl体系条带单一,易于操作。退火温度选择在55℃时无非特异性扩增,35个循环次数易于后续DGGE分析。[结论]已经优化的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

转基因植物种植地土壤微生物区系生态变化及其外源基因的分子检测

对转基因植物种植地土壤中微生物种群数量的影响及外源基因是否转移到土壤微生物中的可能性进行检测,是转基因植物生态安全评价的重要组成部分.本研究从云南省农业科学院大棚采集了转基因西红柿及对照土壤样品12份,采用平板稀释法对该土样中的微生物进行分离鉴定,结果表明种植转基因西红柿的土样中微生物的数量和种类有一定的变化.设计35s启动子、反义基因、卡那霉素抗性标记基因等特异引物对上述土样的总DNA,以及菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因扩增产物.     

末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)在微生物群体分析上的应用与技术优化

末端限制性片段长度多态性技术(T-RFLP)是以荧光标记引物PCR为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法。本文综述了该方法在群体微生物分析上的应用及DNA提取、PCR扩增、酶切和数据分析等步骤的技巧与优化,总结了科学应用该技术的要求以及和多重PCR、gyrB基因等相结合的观点。     

利用DGGE指纹图谱技术考察不同营养条件下土壤微生物群落结构的变化

利用现代分子生物学技术,结合经典方法,克服传统的分离培养缺陷,探讨在不同营养条件下土壤微生物群落的基因多样性。经过直接从土壤中抽提总DNA,并对总DNA中16S rDNA及其中V6~V8可变区序列作PCR扩增、变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析等,发现不同处理条件下的土壤微生物的基因多样性变化与土壤微生物量的波动并不一致,说明微生物群落多样性与微生物量的关系并非线形。同时发现秸秆的添加更有利于土壤微生物群落的稳定。     

富含β-胡萝卜素转基因水稻EH基因水平转移研究

以富含β-胡萝卜素转基因水稻EH喂养大鼠,在90 d喂养试验结束后,分别对大鼠十二指肠、回肠、咬肌及肠道微生物进行相关基因PCR扩增,分析特异性片段在大鼠体内的转移情况。结果显示:试验中饲喂含45%转基因大米饲料、含45%亲本‘中花11'大米配合饲料和全价营养饲料的所有大鼠均未发生基因水平转移,表明转基因水稻EH中的外源基因没有向大鼠的组织和肠道微生物进行转移。     

利用梯度PCR和降落PCR扩增CIRP基因的比较

提取SD大鼠总RNA,同时应用降落PCR和梯度PCR在常规PCR反应体系和低模板浓度PCR反应体系中扩增CIRP基因片段,对两种方法的扩增效果进行比较。结果表明：降落PCR法可以通过一次反应即顺利扩增出CIRP基因特异性条带,并且在模板浓度降低后也能扩增出产物;梯度PCR法扩增结果不稳定,不但有非特异性条带出现而且不能...     

荧光定量PCR技术优化及在草莓上的应用

[目的]为优化荧光定量PCR技术体系并在草莓研究中应用.[方法]以二倍体草莓(Fragaria vesca‘Ruegen’)为试材,草莓当中两个β-肌动蛋白基因家族成员Actin1和Actin2为内参基因,对比分析10 μL和20 μL反应体系条件下荧光定量PCR扩增反应.[结果]内参基因引物组合Actin1的扩增效率等指标优于Actin2;10μL反应体系中的扩增效率等指标优于20 μL反应体系;内参基因Actin1在10 μL反应体系下是草莓最优的荧光定量PCR技术体系.[结论]优化了草莓荧光定量PCR体系并应用该技术体系检测了草莓CrRLK1Ls家族成员的时空表达情况.     

土壤原核微生物RNA加Poly(A)尾的方法研究

采取共提取法提取土壤微生物总RNA后,经过去DNA、过柱纯化等手段,利用Poly(A)聚合酶在纯化RNA末端添加Poly(A)尾,将产物逆转录成c DNA第一链,用细菌16S r DNA引物和nos Z(氧化亚氮还原酶基因)引物扩增目的片段。结果表明:利用此方法能够获得带有Poly(A)尾的土壤原核微生物核糖体RNA和m RNA,产物经过一次转录后,可用于扩增土壤微生物目的基因。此方法相对于利用目的基因特异下游引物来作为逆转录引物获得c DNA更加方便,用于研究土壤原核微生物多个基因的表达特征时,此方法十分实用。     

One tube nested-PCR在SNP基因型分型中的应用

nested–PCR是一种在普通PCR基础上发展起来的专门用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。结合nested–PCR技术在水稻中检测SNP的研究,以1个水稻香味基因Fgr和3个稻瘟病基因Pi–ta、Pi9、Pigm为例,把nested–PCR的4条引物同时加在一管PCR反应中进行扩增,在其序列内针对SNP位点设计功能标记,用来扩增含有突变位点的DNA片段。通过优化引物浓度梯度和改良反应程序,达到了一步快速检测SNP基因型的目的。     

土壤中微生物DNA高效提取方法的筛选

设计了3种从土壤中直接提取微生物DNA的方法,并通过PCR扩增和DGGE电泳比较了不同方法所提取DNA的质量以及对后期分子生物学研究的适用性。结果表明,化学法和酶法相结合的提取方法所获得的DNA完整性最好,适用于PCR扩增,并且通过DGGE电泳分离出最丰富的条带,是一种高效的提取土壤微生物DNA的方法。     

一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法

[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。[结果]2种方法提取的土壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg^2＋用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷。同时适用于PCR分析。为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。     

油用向日葵FAD2-1基因RT-PCR体系的建立与优化

为了建立向日葵FAD2-1基因高效特异的PCR扩增体系,以油用向日葵86-1为材料提取总RNA,并反转录合成cDNA,以cDNA第一条链为模板对FAD2-1基因全长编码序列的PCR体系进行了优化。结果表明:根据已公布的FAD2-1序列设计3对特异性引物,每对引物设计了5个退火温度,筛选出适于该基因PCR扩增的引物及其退火温度,并将PCR扩增条件中循环数缩短为30次,延伸时间缩短为7min,此改进提高了PCR反应的效率。     

用于分子生态学研究的鹅盲肠微生物总DNA提取方法

采用8种方法提取了鹅盲肠微生物总DNA,通过PCR扩增细菌16S rDNA片段的V3区,并对8种DNA提取方法的可行性进行后续分子操作检验。结果表明,方法3提取的鹅盲肠微生物总DNA较好,8种方法通过PCR扩增均能获得较亮的扩增产物,并能通过PCR-SSCP对盲肠微生物多样性进行分析。     

One tube nested-PCR在SNP基因型分型中的应用

nested–PCR是一种在普通PCR基础上发展起来的专门用于检测单核苷酸多态性(SNP)的技术。结合nested–PCR技术在水稻中检测SNP的研究,以1个水稻香味基因Fgr和3个稻瘟病基因Pi–ta、Pi9、Pigm为例,把nested–PCR的4条引物同时加在一管PCR反应中进行扩增,在其序列内针对SNP位点设计功能标记,用来扩增含有突变位点的DNA片段。通过优化引物浓度梯度和改良反应程序,达到了一步快速检测SNP基因型的目的。     

沼气池微生物生态群落PCR-DGGE分析方法研究

研究了适合于PCR-DGGE分析的沼气池污泥样品微生物基因组DNA快速提取方法,探讨了PCR反应条件、电泳时间与上样量对DGGE指纹图谱多样性的影响。试验结果表明,采用本研究所建立的SDS和Guanidine thio-cyanate-N-LS方法提取沼渣微生物总DNA,利用细菌特异性16S rDNA通用引物,经复原条件PCR(循环25次)扩增,所得PCR产物在85V电压下,上样量600ng,电泳时间为16 h时DGGE分离效果最佳,获得清晰的16S rDNA V3区片段的图谱。     

土壤微生物3种DNA提取方法的比较

以人参地土壤为材料,比较研究SDS高盐加变性剂法、SDS高盐法和试剂盒法等3种土壤微生物基因组DNA提取方法.结果表明,3种方法均可提取人参地土壤微生物基因组DNA,但每种方法所获得的DNA在颜色、提取量及纯度等方面都存在较大差异.普通手工方法(SDS)提取的DNA由于纯度不高等原因很难进行后续的PCR扩增,试剂盒法能够在较短时间内获得用于PCR扩增的较高纯度的DNA,所以该方法是较好的土壤微生物DNA提取方法.     

不同环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化

采用SDS高盐缓冲液抽提法提取了林地、厂区、菜地3种不同环境中土壤微生物总DNA,结果表明,该方法可以从土壤微生物中提取到长度大于23.1kb的DNA;不同环境中提取的DNA产量和纯度都存在一定的差异,每克干土的DNA提取量介于53.55~579.93μg之间,其中以处于原始状态的丛林提取量最高。粗提的土壤微生物DNA采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂进行纯化,纯化后的土壤微生物DNA可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增到相应的片段。     

PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析的影响

利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)探讨不同PCR反应程序(降落式PCR、巢式-降落式PCR、普通PCR、巢式PCR)对土壤微生物PCR-DGGE群落结构和种群多样性分析的影响。利用Quantity One4. 6. 2软件对DGGE指纹图谱进行数字化处理,并计算相应PCR程序下DGGE图谱的多样性指数、丰富度指数、均匀度指数和不同反应程序下图谱的戴斯系数,应用SPSS 16. 0软件对相关指数进行方差分析,检测不同反应程序间各指数的差异显著性。不同PCR反应程序在土壤微生物PCR-DGGE分析时,其群落结构和种群多样性指数间存在明显差异。单纯应用降落式PCR虽然提高了扩增的特异性,却降低了扩增效率,其DGGE图谱丰富度较低,多样性较差,与其他反应程序的DGGE图谱相似度较低;普通PCR反应的DGGE图谱多样性和丰富度较高,与2种巢式PCR相似,然而由于普通PCR在复杂模板情况下容易发生错配,难以保证扩增特异性,因而夸大样品中微生物种群多样性,与2种巢式PCR的DGGE图谱相似度较低。2种巢式PCR反应程序下的DGGE图谱条带丰富,多样性高,群落结构相似度高,能比较全面和科学地反映样品中微生物群落结构和种群多样性。因此,在利用PCR-DGGE分析土壤微生物群落结构和种群多样性时,采用巢式PCR(包括巢式PCR和巢式-降落式PCR)比较合适。研究PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析的影响,可为PCR-DGGE技术在土壤微生物群落结构和多样性分析中的应用和完善提供理论依据。     

土壤镰刀菌种群检测的巢式PCR-DGGE方法的建立

本试验比较了4种提取小麦-玉米轮作免耕田土壤DNA的方法,并对巢式PCR反应体系和扩增条件进行了优化,建立了适合检测土壤中镰刀菌多样性的PCR-DGGE体系。结果表明:土壤DNA的质量是影响PCR扩增结果的关键因子,试剂盒Fast DNA SPINfor Soil所提土壤DNA片段接近23 bp,A260/A280比值为1.84,DNA产量为18.1μg/g,更适合进行PCR反应。DNA模板的浓度决定PCR扩增结果,第一轮PCR扩增的DNA模板适宜量为2～5 ng,以第一轮PCR产物的原液为模板进行第二轮PCR扩增,在退火温度为67℃时扩增结果最好。PCR产物在变性范围为45%～60%的丙烯酰胺梯度凝胶中电泳7～8 h,其条带能够完全分离,可以用作土壤中镰刀菌多样性的检测。