大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

植物启动子响应非生物逆境胁迫研究进展

不良的非生物逆境胁迫会制约植物生长发育,导致作物减产和质量受损。植物诱导型启动子在胁迫因子刺激下响应胁迫信号而激发调控机制和激活抗逆基因的表达,导致代谢组分和生理生化等指标发生变化,从而提高植株的抗逆能力。分析了诱导型启动子的种类和功能,介绍了响应非生物逆境胁迫的顺式作用元件及反式作用因子,以期为进一步研究植物诱导型启动子的功能奠定基础。     

3个陆地棉球蛋白基因启动子的克隆与功能初步分析

为克隆陆地棉来源的种子特异性启动子,根据雷蒙德氏棉测序结果,设计针对GhαGLOA、GhβGLOA和GhβGLOB基因编码区上游约1.5 kb序列的引物,分别以陆地棉总DNA为模板克隆了3条序列。构建了含有编码区上游序列驱动GUS的表达载体,经农杆菌介导转化野生型拟南芥。转基因拟南芥种子的GUS活性荧光检测结果表明,所克隆序列具有启动子功能,其中GhαGLOA启动子的转录活性极显著高于其他2个启动子。在转基因拟南芥成体植株的多个器官中,仅可检出痕量的GUS活性,认为所克隆启动子为种子特异性启动子。     

甘薯几丁质酶基因IbChiA启动子的克隆及功能分析

几丁质酶能够水解真菌细胞壁,抑制真菌的生长与繁殖,水解产物还能诱导植物的系统抗性,在植物抗病过程中发挥重要的调控作用。本实验室前期从甘薯中克隆了几丁质酶基因IbChiA并对其进行了功能验证和表达分析,结果表明黑斑病菌强烈诱导IbChiA基因的表达,且在不同抗性甘薯品种中的表达差异显著。在此基础上,本研究在抗感品种中分别克隆了IbChiA基因的2 034 bp的启动子序列,对比后发现其序列并无差异。PlantCARE在线分析显示,IbChiA启动子中包含核心元件TATA-box和CAAT-box,还有响应真菌诱导的作用元件(W-box)以及植物激素等相关的顺式作用元件。将IbChiA基因的全长启动子及7个启动子5’端缺失片段分别替换植物表达载体pHB的2xCaMV 35S启动子,并在本生烟草叶片中进行瞬时表达。eGFP的荧光及定量表达分析显示在基因上游600 bp及以上都能够正常稳定地发挥启动子的功能,其中在-1 605～1 188 bp的片段内可能存在增强转录的顺式作用元件。本研究为进一步探索甘薯IbChiA基因的调控和表达机制提供了理论依据,并为甘薯抗病基因工程提供了一个理想的候选启...     

小麦谷氨酰胺合成酶同工酶转录特点及其启动子序列分析

谷氨酰胺合成酶是小麦氮同化关键酶,分为胞液型和质体型(TaGS2)两类,其中胞液型TaGS又分为TaGS1、TaGSr和TaGSe。为了研究异源六倍体小麦A、B、D染色体组TaGS同工酶表达差异及调控机制,本项目利用三代测序技术测定了TaGS同工酶基因转录水平,依据中国春基因组序列克隆了豫麦49的12个TaGS同工酶启动子,并对其序列进行了分析。结果表明,TaGS1主要由6B染色体基因转录,TaGSe和TaGSr主要由4D染色体基因转录,TaGS2主要由2D染色体基因转录,不同TaGS同工酶转录起始位点距起始密码子ATG的距离不同。启动子元件分析显示,6B染色体上的TaGS1启动子有较多W-box、AC-I、ABRE、as-1和茉莉酸甲酯等响应元件,4D染色体上的TaGSe启动子有较多胁迫响应转录因子(MYB、MBS、LTR等)结合元件和植物生长素响应元件,4D染色体上的TaGSr启动子有较多WRE3等转录因子结合元件,2D染色体上的TaGS2启动子有较多A-box、WRE3、ARE及AT富集区。不同TaGS同工酶启动子顺式元件种类、数目及排列顺序均不同,为进一步研究GS同工酶调控机制奠定了基础。     

用气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定烟草染色体倍性方法初探

经不同浓度秋水仙碱液加倍处理的烟草花粉植株，用叶片气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定染色体倍性。研究表明：气孔保卫细胞叶绿体数平均值差异极显著，单倍体95％以上的叶绿体数在14个以下，双倍体95％以上的叶绿体数则在14个以上。经开花结实验证其准确率达91％，且展开到第5叶时就可鉴定。     

拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价

RBCS编码光合碳同化关键酶核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基, 是控制植物光合作用的重要基因之一。本研究利用实时荧光定量PCR技术分析拟南芥RBCS-1A受光调节表达模式, 结果表明, AtRBCS-1A表达受光诱导, 同时具有组织表达特异性; 运用生物信息学手段分析发现, 该基因启动子序列中存在多个参与光应答的顺式作用元件; 采用PCR技术从拟南芥基因组中分离到长度为1 691 bp的AtRBCS-1A启动子片段, 将该片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体并转化野生型拟南芥, 对获得的转基因植株进行GUS染色, 结果显示, AtRBCS-1A启动子是光诱导型和组织特异型启动子。以上结果初步证明, AtRBCS-1A启动子应用于植物遗传转化切实可行, 具有重要应用价值。     

棉花半乳糖基转移酶基因GhGalT1启动子的克隆及表达分析

糖基转移酶(glycosytransferase, GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶类, 在应答多种生物和非生物胁迫中起重要作用。本研究利用PCR技术从陆地棉品种Coker 312基因组中分离克隆了GhGalT1基因的启动子, 序列长度为539 bp, 命名为pGhGalT1。启动子分析软件PlantCARE分析表明pGhGalT1含有CAAT-box、TATA-box核心元件, 以及响应干旱、热、脱水、防御与胁迫应答的顺式作用元件MBS、HSE、MYCCONSE、TC-rich repeats和CGTCA-motif等。因此将pGhGalT1构建到启动子检测载体pBI101-GUS上, 形成pBI101-pGhGalT1-GUS融合表达载体, 以检测其启动子活性。通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥, 经卡那霉素抗性筛选及PCR检测成功获得阳性转基因植株。对T₃代转基因拟南芥进行组织化学染色分析显示该启动子主要在生长5~15 d的幼苗主根及侧根根尖表达, 在子叶及莲座叶边缘也有微弱表达。非生物胁迫和激素处理后的组织化学染色、GUS酶活性及GUS基因定量分析结果显示GhGalT1基因的启动子受盐、渗透胁迫和激素(6-BA、MeJA、BL)的诱导, 该结果为合理选用启动子改良作物提供理论依据。     

棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

小麦蛋白磷酸酶2A基因TaPP2AbB″-α启动子的克隆及表达分析

植物蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)由结构亚基A、调节亚基B和催化亚基C组成,在应答逆境胁迫途径中发挥着重要作用。小麦基因Ta PP2Ab B″-α是调节亚基亚家族B″的成员,过量表达该基因可以促进拟南芥的根系生长及侧根发育,在盐胁迫和渗透胁迫条件下的作用更显著。本研究从小麦(Triticum aestivum L.)抗旱品种"旱选10号"基因组中克隆了Ta PP2Ab B″-α基因的启动子PB″α,序列长度为1899 bp,含有TATA-box和CAAT-box,以及响应干旱和渗透胁迫的顺式作用元件EECCRCAH1(?1058 bp至?1052 bp)、GCCCORE(?1073 bp至?1068 bp)和MYCCONSE(?1179 bp至?1174 bp)。将启动子PB″α和5种5′端缺失启动子片段与报告基因GUS(β-glucuronidase)连接后转化拟南芥,组织化学染色结果显示PB″α在植株的叶片和根中均有表达。5′端缺失分析表明缺失片段PB″α-1545和PB″α-1389具有启动子活性,活性区域位于?1389 bp和?946 bp之间。GUS定量分析结果显示,在盐和渗透胁迫条件下,PB″α、PB″α-1545和PB″α-1389的活性显著上升。本研究表明PB″α具有较强的启动子基本活性,并且在盐胁迫及渗透胁迫条件下活性显著上升,该结果为合理选用启动子改良作物提供了依据。     

水稻组织特异型人工合成启动子的设计、构建及功能鉴定

合成启动子是合成生物学的一个重要研究领域及研究热点。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,亦是禾本科作物功能基因组研究的模式植物。本研究旨在对水稻组织特异表达启动子的合成作有益尝试。根据已发表的文献选取了一些与组织特异表达相关的顺式元件,将它们以不同的方式组合并连接Mini 35S核心启动子以驱动GUS报告基因的表达。转基因水稻的GUS组织化学染色和酶活测定结果证实,通过上述方法在水稻中成功构建出组织特异型合成启动子,同时也揭示了顺式元件在合成启动子中不同的组合方式对启动子的表达活性和表达模式起着关键作用。本研究为植物合成启动子的设计思路和构建方法提供了有益信息和实践基础。     

棉花光合基因GhRCAα启动子的克隆及活性分析

为了克隆棉花Rubisco活化酶基因(RCA)启动子,研究其表达调控的分子机制,以百棉1号为材料,对GhRCAα启动子区2 000 bp的片段进行克隆、顺式作用元件分析以及活性分析,结果表明,许多重要的顺式作用元件包括响应于光、生物钟、逆境胁迫、植物激素以及其他的基本顺式作用元件特异地存在于GhRCAα启动子区;进一步对GhRCAα进行表达特性分析发现,该基因在光合作用进行的主要位置叶片中表达量最高,在其他组织表达量很低,其表达具有组织特异性,这与该启动子区存在许多光响应及组织特异性表达相关元件的结果相一致;将克隆的GhRCAα启动子片段以烟草叶片为受体材料进行瞬时表达分析表明,GhRCAα启动子可以驱动GUS基因的表达,表明克隆的启动子片段具有驱动目标基因表达的活性。克隆的GhRCAα启动子可能是一种组织特异型启动子,有望用于植物的遗传转化,进而更好地调控重要基因的特异性表达。     

逆境启动子的鉴定及在大豆中的应用

为减少抗逆分子育种中因引入外源抗性基因造成的基因多效性,降低外源基因对植物的伤害,本研究设计并合成逆境响应顺式元件不同组合的启动子,将其连上GUS报告基因后转化为拟南芥野生型Col-0;通过转基因拟南芥中GUS报告基因的表达强度分析各种启动子对干旱和盐害的响应情况,筛选出了在正常条件下无渗漏、在干旱和盐害胁迫下被诱导的启动子AXpro。然后,利用发根农杆菌介导转化大豆,发现干旱诱导生物钟基因GmTIC的沉默能提高大豆的抗旱能力。研究结果为农林业的抗逆分子育种提供了理论基础和应用方法。     

大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

棉花GhMADS29启动子克隆及表达分析

以实验室克隆的GhMADS29(GeneBank登录号:JQ682642)基因的cDNA序列Blast搜索雷蒙德氏棉的基因组序列,根据Blast结果设计引物,克隆到起始密码子上游-19位开始的1316 bp的序列;利用PlantCARE启动子在线分析软件预测其含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box,并含有光、温、赤霉素、水杨酸、生长素等的响应元件.通过替换pBI121载体上的CaMV35S启动子构建了GhMADS29启动子与GUS基因的融合表达载体并转化拟南芥,组织化学染色分析发现其在14d幼苗的根和叶中都有表达,在萼片、花瓣、雌蕊、果瓣中也表达,而在雄蕊和种子中不表达.综上所述,我们推测GhMADS29可能与各种开花途径有关,与萼片、花瓣、雌蕊等花器官的发育有关,还可能与果实是否开裂有关.