水稻温敏型叶片白化突变体tsa1的表型鉴定和基因定位

一个由甲磺酸乙酯(EMS)诱变宁粳36水稻品种获得的温敏型叶片白化突变体tsa1在低温条件下(20~24°C)表现叶片白化,但在较高温度下(28~32°C)叶色与野生型无显著差异。突变体白化叶片中叶绿素a和类胡萝卜素含量与野生型相比显著下降。显微观察发现突变体白化组织中正常叶绿体数量稀少,包含大量小型的异常叶绿体,进一步用透射电镜观察发现异常叶绿体中无发育完整的类囊体片层结构,表明该突变体中叶绿体发育存在严重缺陷。遗传分析表明该突变性状受单个隐性核基因控制。利用tsa1与南京11杂交所得的F₂群体中的368个隐性极端个体,将该突变基因定位于第5染色体长臂163 kb的范围内。本研究为该基因的图位克隆及功能解析奠定了基础。     

水稻温敏感失绿突变体tcd51的遗传分析及其基因定位

从粳稻品种‘嘉花1号’的60Coγ射线辐照的后代中筛选到一个水稻温敏感失绿突变体tcd51,该突变体在24℃条件以下,幼苗从三叶期开始呈白色失绿,而28℃以上条件下其表型与野生型‘嘉花1号’一致,呈正常绿色,表明其幼苗叶色失绿是一种温敏感性状。透射电镜观察表明,突变体tcd51的叶绿体在20℃条件下发育不全,且光合色素含量明显下降,而在32℃条件下叶绿体结构和光合色素含量与野生型基本一致。遗传分析表明,该温敏感失绿突变表型受1对隐性核基因(tcd51)控制。利用该突变体与‘培矮64S’杂交构建F2群体以及InDel和SSR分子标记,将tcd51基因定位在水稻第5染色体上的ID5与ID7分子标记之间的507 kb的区间内,跨越6个BACs,包含26个ORFs。转录表达分析表明,tcd51突变体在20℃低温条件下叶绿素合成、光合作用和叶绿体发育相关基因(PORA,psa A,psb A,rpo B,rpo C)转录水平大幅度下调,而在32℃条件下与野生型无明显差异,说明TCD51可能是一个低温响应且受低温影响的水稻苗期生长的关键基因。本研究为tcd51基因的进一步克隆和功能探索提供了一定的参考。     

水稻密穗突变体A989突变基因克隆和转基因植株分析

从水稻T-DNA插入突变群体中分离得到一个密穗突变体A989,表现晚开花、穗二级枝梗和小花数增加以及包颈。分子检测证明A989中T-DNA是单拷贝插入,通过inverse PCR的方法分离得到A989中T-DNA的旁邻序列,表明T-DNA插入在RCN2基因polyA加A位点后330bp处;RT-PCR检测发现在A989中,RCN2基因的表达被显著上调。利用2×35S启动子在野生型水稻Zhonghua 11中超表达RCN2基因,转基因植株表现为不抽穗,通过细胞学观察发现转基因植株能完成营养生长向生殖生长的转变,但是生殖生长期的分生组织在分化出二级枝梗原基后停止分化和生长。此外,通过比较部分开花相关基因在野生型Zhonghua 11、突变体A989中的表达,推测了RCN2基因可能的作用途径。     

一个新的水稻细条纹叶色突变体特性分析和基因克隆

叶色突变体作为一种易于观察的性状突变,是开展光合系统的结构和功能、叶绿素生物合成及其调控机制研究的理想材料。本研究以水稻T-DNA插入细条纹叶色突变体为研究材料,通过叶片的形态鉴定、石蜡切片、叶绿素和光合速率测定,分析突变体的表型和光合特性;采用TAIL-PCR技术,定位和克隆该突变基因。结果表明:突变体苗期幼叶上呈现间断的白色细条纹,而叶鞘、叶脉表现正常,三叶期后至分蘖期叶片逐渐转绿;突变体叶色对温度变化敏感;是国内外尚未报道的一种新型水稻细条纹叶色突变体。根据T-DNA插入标签,确定突变候选基因位于第7染色体上,并对候选基因进行了克隆已获得部分cDNA序列,暂命名为fs3(t)。     

水稻单叶独立转绿型黄化突变体grc2的鉴定与基因精细定位

转绿型叶色突变体是研究植物叶绿体分化与发育的基础材料。grc2是利用60Co-γ射线诱变籼型三系保持系T98B后获得的单叶独立转绿型黄化突变体。grc2植株上任一叶片刚抽出时为黄色,在生长10 d左右后变绿,具有单叶不依赖于植株特定发育阶段而独立转绿的特性。与野生型T98B相比,grc2黄化叶片的总叶绿素和叶绿素b含量显著降低,叶绿体滞留在黄化质体阶段,表明grc2可能在叶片早期发育中起关键作用。遗传分析表明,grc2受1对隐性核基因独立控制;利用源于grc2/Nipponbare的F2群体的960个突变单株,将grc2基因定位在STS标记S254与S258之间约31 kb的范围内,该区域含有5个未报道过的注释基因。这些结果为grc2的克隆及功能研究提供了重要信息。     

一个水稻黄叶突变体的叶绿素合成关键基因的表达分析

为了研究水稻黄叶突变基因与叶绿素合成途径的关系及突变基因的作用机理,本研究以野生型作对照,结合半定量与实时定量PCR技术,对突变体茎和叶组织中叶绿素合成关键基因的RNA表达水平进行了分析。结果显示,在茎组织中,研究选取的8个基因在突变体和野生型中的表达均没有明显差别。而在叶组织中,突变体的YGL1和CHLI两个基因的表达量约为野生型的1.8倍,表达明显上调;CHLD基因的表达量约为野生型的0.6倍,表达明显下调;其余5个基因的表达没有明显差别。研究表明,突变基因能够调控叶绿素合成关键基因YGL1、CHLD和CHLI的表达,从而影响叶组织中叶绿素的合成,这为进一步研究突变基因对叶绿素合成的调控模式及其作用机理奠定了基础。     

拟南芥低叶绿素荧光LCF3基因的克隆与功能分析

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥EMS诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体lcf3-1 (lower chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示LCF3是PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果, 均证明LCF3基因突变导致拟南芥叶绿素荧光F_v/F_m值降低。进一步实验证明LCF3蛋白定位于叶绿体, 且LCF3基因在植株中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。     

芝麻黄化突变体YL1的叶片解剖学及光合特性

表型性状标记在作物遗传育种中具有重要的应用价值。在芝麻地方种质"庙前芝麻"中发现了能够稳定遗传的黄化突变体YL1,对该突变体的叶片解剖特征、光合特性及农艺性状的比较分析表明,突变体YL1黄化心叶和平展叶在各个发育时期的叶绿体结构均与同时期野生型存在明显差异,下表皮气孔保卫细胞数是正常叶的2倍左右。YL1的叶绿素a、总叶绿素、类胡萝卜素含量均只有同时期正常含量的30%~40%,叶绿素b含量只有正常叶的20%;光合速率在初花期及以前均显著低于同期正常叶,但到终花期与正常叶相当;YL1的生育期和初花期显著推迟,株高和单株蒴果数明显降低,每蒴粒数和千粒重略微降低。显微观察表明,YL1的叶绿体形态结构发育不规则,基粒和基粒片层数目明显少于野生型,使得叶绿素含量过低,属于叶绿体发育异常导致的叶绿素缺少型突变体。     

水稻叶缘白化突变体mal的遗传分析与基因定位

植物叶色变化对叶绿体发育和叶绿素生物合成等光合系统结构和调控机制的研究有着重要的理论意义。水稻叶缘白化突变体mal (marginal albino leaf),来源于恢复系缙恢10号(Oryza sativa L.ssp. indica)的EMS诱变群体,经过多代自交,其突变性状遗传稳定。与野生型相比,mal突变体整个生育期叶片边缘白化且叶片变窄,抽穗期倒三叶叶片、倒二叶叶边缘以及倒三叶叶边缘的叶绿素含量极显著降低。透射电镜观察发现,mal突变体叶片绿色部位细胞与叶绿体发育完全,白化部分叶肉细胞大部分中空,无明显完整的细胞器,叶绿体内部完全降解。遗传分析表明该突变体受隐性核基因控制,MAL被定位在第8染色体上SSR标记M22和InDel标记ID27之间,物理距离为171 kb。本研究将为MAL基因的图位克隆及功能研究奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

水稻黄叶突变体ys94的鉴定与基因定位

水稻突变体ys94,是一个来源于化学诱变的叶色突变体。突变体在三叶期前出现明显的黄叶表型,叶绿素a、叶绿素b含量下降;透射电镜观察表明,突变体叶片叶绿体数量减少、类囊体片层退化。三叶期后叶色开始转绿。成熟期突变体ys94的分蘖数减少,但在结实率和株高等性状上与野生型相比并无明显差异。遗传分析表明,ys94的突变性状由一对隐性核基因控制。利用ys94×DJY组合的F_2定位群体,将突变基因定位在第8染色体短臂标记M8-3和M8-24之间,两标记间的物理距离为140kb,此区间包含11个候选基因。本研究结果为候选基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

水稻白化转绿基因Gra3的精细定位及遗传分析

本研究鉴定到一份水稻苗期白化转绿突变体,该突变体在幼苗的2叶到4叶期会出现叶片边缘白化,4叶期后转绿,对突变体和野生型农艺性状比较研究表明,前期白化不会对植株生长发育及产量等相关性状产生影响;同时,对两者叶绿体超微结构对比分析发现,突变体叶绿体发育在白化期受到一定程度的抑制。通过构建F2分离群体,调查了部分F2单株表型,结果表明白化型和野生型单株符合1:3的孟德尔单基因分离比,遂将该基因命名为Gra3;利用分离群体分析法(bulked segregant analysis,BSA)和隐性群体分析法(recessive-class analysis,RCA)最终将Gra3定位于RM14436和RM14450之间,对应日本晴基因组片段125 kb。该性状可作为一个形态学标记应用于水稻生产。     

一个 T-DNA 插入突变体的分子鉴定及表达分析

突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过RT-PCR结果分析表明, T-DNA插入的突变体植株中OsFCA基因完全不表达。另外,在短日照条件下,对水稻成花相关的2个重要基因Hd1和Hd3a的RT-PCR分析表明,在野生型植株中,2个基因的表达量都明显高于突变体植株,尤其是在夜间的表达量相差较为明显。说明OsFCA在短日照条件下通过正向调控Hd1和Hd3a的表达促进水稻的开花。     

一个水稻温度敏感失绿突变体的遗传分析及分子定位

从粳稻品种"嘉花1号"60Coγ射线辐照的后代中筛选到一个水稻温敏感失绿突变体tcm12,在20℃条件下的该突变体第2、3幼叶表现为失绿,第4叶开始完全转绿。而24℃以上条件其表型与野生型嘉花1号一致,呈正常绿色,表明其幼苗叶色表现出失绿是一种温度敏感性。透射电镜观察结果表明,突变体叶绿体在20℃条件下发育不全,而在32℃条件下正常发育。遗传分析表明,突变体的温度敏感失绿性状受1对隐性核基因(tcm12)控制,利用SSR和InDel分子标记以及广占63S/tcm12后代中76株F2突变型植株,将tcm12基因初定位在水稻第12号染色体长臂上的RM519和ID22406之间,然后,进一步利用目标区域内分子标记多态性较好的9311/tcm12组合的F2中分离出的157株突变型植株,最终将tcm12基因锁定在分子标记ID21199和ID21436之间的237kb内。本研究结果为今后对该基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。     

水稻低叶绿素含量突变对光合作用及产量的影响

突变体水稻叶绿素含量仅是其野生型水稻的51%,但是其饱和光合值在低氮、中氮、高氮处理下,却比对照野生型水稻分别高3.7%、20.4%与39.1%。为了探究其生理学机制,分别在大田与盆栽试验中,不同氮肥水平研究了突变体材料与野生型材料的叶片Rubisco酶含量、气孔导度、水通道蛋白表达水平、叶绿素荧光、叶片解剖结构和叶绿体超微结构。叶绿体超微结构表明突变体材料虽然叶绿素含量降低,叶绿体的发育并未受到影响;叶绿素荧光试验结果表明,高光强下,低叶绿素含量突变体并未受到光抑制,光反应电子传递未受影响。气孔导度数据、叶片显微结构观察与水通道蛋白基因表达数据表明叶黄突变体具有较高的气孔与叶肉导度;同时低叶绿素含量突变体内较高的Rubisco酶含量也是其在高光照条件下具有较高光合速率的重要原因。产量数据表明,叶黄突变体虽然生育期短,但其产量水平与对照无显著差别,这可能与其高光强条件下有较高的光合速率有关。上述试验结果表明高叶绿素含量并不是叶片高光合速率的必需条件。在今后的高光效育种中,挑选叶绿素含量适宜的品种更有利于叶片内氮素在其他光合器官中的分配,提高光合效率,最终获得高光效品种。在本研究中使用的叶绿素含量降低突变体在高光效育种中有潜在的研究价值。     

水稻淡黄叶矮化突变体yld的遗传分析及基因定位

水稻叶色突变体是研究植物光合作用、叶绿素代谢和叶绿体发育的重要材料。本研究从籼稻品种蜀恢527经EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理后代中筛选出一个淡黄叶矮化突变体Yellow leaf and dwarf(yld)。与野生型蜀恢527相比,该突变体全生育期都表现出淡黄叶矮化性状,其剑叶的淡黄色表型最为明显,倒二叶次之,倒三叶最弱,其中剑叶的叶绿素及类胡萝卜素含量降低最为明显;并且伴随着穗粒数、千粒重、结实率、株高等主要农艺性状的显著降低,但有效穗显著增多。透射电镜观察结果显示,与野生型相比,该突变体多数叶绿体结构基本完整,但基粒模糊,基质片层大量减少且排列疏松。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因控制。在yld突变体与粳稻武运粳7号杂交的F2群体中分离出323个突变单株,最终将YLD基因定位在第11染色体的L5和L7两标记之间,物理距离为115.7 kb。本研究为YLD基因的克隆和功能分析奠定了基础。     

一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析及突变基因的精细定位

在水稻品种Dongjin的T-DNA插入突变体库中筛选到一份黄绿叶突变体T113,该突变体在生长的整个时期叶片都呈现黄绿色,且越到后期表型越明显。T113与野生型亲本Dongjin相比,叶片光合色素含量明显降低,株高变矮,结实率降低,每穗着粒数、穗长和千粒重均明显减少,抽穗期延迟,且黄绿叶性状不受温度影响,叶绿体中的类囊体排列较为疏松,出现更多的嗜锇体,叶绿素合成和质体发育相关基因表达量发生改变。遗传分析表明,T113的突变性状由1对隐性核基因控制。利用T113/N22的F2群体,将突变基因定位在第2染色体长臂Indel标记CX2和JX18之间,物理距离约为79 kb,此区间内包含12个预测基因。     

拟南芥长链脂肪醇氧化酶(AtFAO3)在抗病防卫反应中的作用分析

长链脂肪醇氧化物酶(FAO)基因编码一个与膜结合,包含黄素,产生H_2O_2的长链脂肪醇氧化酶.在拟南芥基因组中包含4个FAO同源基因.然而,拟南芥FAO在响应非生物和生物环境胁迫中起何种作用还不得而知.本研究中,我们分析了拟南芥AtFAO3在植物防卫病原细菌Pseudomonas syringae pathovar(pv.)tomato strain DC3000(Pst DC3000)中的作用.拟南芥原生质体细胞瞬时表达AtFAO3偶联GFP融合蛋白表明,AtFAO3定位于细胞膜.与野生型植株相比,拟南芥AtFAO3基因T-DNA插入突变体Atfao3在正常条件叶片中H_2O_2含量下降,在氧胁迫或生物胁迫下积累活性氧含量减少.接种病原细菌Pst DC3000后,与野生型植株相比,Atfao3突变体体内细菌繁殖数量增加,叶片病害症状加重,防卫相关基因PR1、PR2和PAL表达减弱.我们基于以上T-DNA突变体分析结果表明,AtFAO3在植物对病原细菌防卫中起重要作用.     

T-DNA插入产生的水稻多分蘖突变的遗传分析

在筛选和鉴定水稻T-DNA(含Basta抗性基因Bar)插入纯合体的过程中，观察到一个多分蘖的突变体。其分离群体中多分蘖和正常分蘖两种植株类型的分离比率为3∶1，符合1对基因的显性遗传。Basta 抗性检测、PCR分子检测及Southern杂交证实，该突变体是由单一T-DNA插入引起的，多分蘖性状与T-DNA共分离。该突变材料可用于插入座位的