刚毛柽柳ThγGCS基因克隆及表达分析

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是植物细胞内谷胱甘肽(GSH)生物合成的限速酶,在植物许多的生理过程中具有重要作用。从刚毛柽柳转录组数据库中分析并获得1条刚毛柽柳γGCS基因全长c DNA序列,命名为ThγGCS。该基因全长2 121 bp,开放阅读框为1 536 bp,编码511个氨基酸。生物信息学分析结果表明,ThγGCS推导的氨基酸序列分别与苜蓿、大豆以及橡胶树等具有很高的同源性;进化分析结果表明ThγGCS属双子叶植物γGCS亚类,同橡胶树,芥菜等γGCS分为一组,与单子叶植物的亲缘关系较远。该蛋白质无跨膜结构域,但具有1个保守的GCS2结构域,并被定位于叶绿体中,说明ThγGCS蛋白质较稳定,并属于谷氨酰半胱氨酸连接酶家族。为了研究该基因在不同非生物胁迫下的应答情况,利用实时定量RT-PCR技术,分析ThγGCS在NaCl和PEG胁迫处理后不同时间、不同组织中基因的表达。结果表明,ThγGCS受NaCl、PEG诱导上调表达,推测其可能在刚毛柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。     

观赏羽衣甘蓝BoMYB114基因编码区的克隆及序列分析

花青素是羽衣甘蓝叶片呈紫色、红色及粉色的重要色素,R2R3-MYB类蛋白被认为是调控植物花青素生物合成的转录因子。本研究以羽衣甘蓝叶片为试材,采用同源克隆的方法克隆BoMYB114转录因子基因的编码区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:BoMYB114基因编码区长度为753 bp,其包含1个完整的开放阅读框ORF,可编码250个氨基酸,预测蛋白的分子量为28.5 kD,等电点(pI)为9.08。BoMYB114蛋白不存在信号肽,很可能定位在细胞核中。BoMYB114蛋白含有2个MYB保守结构域,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角为主。进化树分析表明,羽衣甘蓝的BoMYB114蛋白与甘蓝型油菜MYB114蛋白序列的一致性最高。羽衣甘蓝BoMYB114基因的克隆与序列特征分析对于进一步研究该基因结构和功能及植物花青素合成代谢途径具有重要意义。     

茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶1号不同白化阶段的表达

高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果, 采用RT-PCR和RACE技术克隆了3个茶树叶绿素合成相关基因, 分别为谷氨酸-tRNA还原酶(CsGluTR)、叶绿素合酶(CsChlS)、叶绿素酸醋氧化酶(CsCAO), 对应的GenBank的登录号为HQ660371、HQ660370、HQ660369。序列分析表明, CsGluTR基因全长2165 bp, 开放阅读框长1665 bp, 编码554个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.6 kD, 理论等电点为8.78;CsChlS基因全长1463 bp, 其中开放阅读框长1125 bp, 编码374个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为40.5 kD, 理论等电点为8.58;CsCAO基因全长2146 bp, 其中开放阅读框长1611 bp, 编码536个氨基酸, 推测的蛋白分子量约为60.8 kD, 理论等电点为8.03。比对分析表明, 3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的相似性均在70%以上。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在不同白化阶段的表达,表明, CsChlS和CsCAO基因具有明显的表达协同性, 它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步;而CsGluTR在白化叶片和正常叶片中的表达差异相对较小, 同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中, 叶绿素的合成机制受到较大影响, 叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。     

油菜O-acetylserine (thiol) lyase isoform A(OASTL)基因的克隆及序列分析

植物OASTL蛋白是半胱氨酸生物合成过程中的关键酶,催化半胱氨酸合成的最后一步。克隆低镉积累基因型油菜中OASTL基因,为研究该基因在镉积累过程中的功能提供参考。本研究以镉低积累品种美国‘油王88’幼苗为材料,采用同源克隆法PCR扩增OASTL基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到美国‘油王88’OASTL基因cDNA编码区长为969 bp,编码322个氨基酸;编码蛋白的理论分子量为33.9 kD,理论等电点为5.50,溶液中的不稳定指数为27.45,为稳定蛋白,属于磷酸吡哆醛(PLP)依赖型的β-取代丙氨酸合成酶超家族成员。氨基酸序列聚类分析表明,其与花椰菜和小白菜的相似性最高。亚细胞定位预测分析表明,OASTL蛋白定位于细胞质中,推测OASTL蛋白主要在细胞质中发挥重要作用。OASTL基因的克隆及其结构、性质与功能的初步分析,为油菜抗重金属育种提供理论基础和基因资源。     

海岛棉DAHP基因的克隆及分子特性分析

棉花黄萎病严重影响中国的棉花产量和品质。本研究以海岛棉cDNA为模板扩增得到3个DAHP基因片段,分别命名为GbDAHP-1、GbDAHP-6、GbDAHP-7。序列分析显示,GbDAHP-1基因全长为1 755 bp,编码539个氨基酸,理论分子量为59.4 kD,等电点为8.70;GbDAHP-6基因全长为1 644 bp,编码519个氨基酸,理论分子量为57.176 11 kD,等电点为8.94;GbDAHP-7基因全长为1 554 bp,编码517个氨基酸,理论分子量约为57.177 14 kD,等电点为8.12。通过在线软件分析得知3个蛋白质的理化性质相似,均为亲水性蛋白,不含跨膜运输结构域,位于叶绿体。系统发育树显示：GbDAHP-1、GbDAHP-6和GbDAHP-7基因与陆地棉、雷蒙德氏棉、可可的序列相似度较高,与陆地棉以及雷蒙德氏棉的蛋白质相似度最高,亲缘关系最近。在黄萎病菌诱导下GbDAHP基因显示先上升后下降的趋势,表明该基因受到黄萎病菌诱导表达。     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

油菜B-box型锌指蛋白基因BnSTO的克隆和表达

B-box型锌指蛋白参与植物多种生长发育和非生物逆境胁迫响应过程。笔者通过RT-PCR克隆得到甘蓝型油菜2个B-box型锌指蛋白基因Bn STO-1和Bn STO-2。Bn STO-1的ORF长度为723 bp,推测编码240个氨基酸,定位于A8染色体。Bn STO-2的ORF长度为726 bp,推测编码241个氨基酸,定位于C8染色体。2个基因均由3个外显子和2个内含子构成,在氨基酸水平上的相似性达到了96.68%。系统进化分析表明Bn STO与拟南芥At STO的亲缘关系较近,同源性较高。荧光实时定量PCR结果表明Bn STO在检测的各个组织中均有表达,其中叶和蕾中的表达量最高;高盐、干旱和高温能显著诱导Bn STO-1和Bn STO-2的表达,但出现峰值的时间不同,推测2个基因均可能参与了油菜的非生物逆境胁迫响应。     

樟叶越桔过氧化氢酶VdCAT1基因的克隆与生物信息学分析

作为植物抗氧化防御系统的主要保护酶之一,过氧化氢酶在植物细胞响应逆境胁迫应答方面发挥重要作用。本研究通过生物信息学分析RNA-Seq数据(NCBI登录号:PRJNA285946),结合RT-PCR技术首次从樟叶越桔成熟叶片中获得了过氧化氢酶基因VdCAT1全长为1 611 bp的cDNA序列,完整开放阅读框(ORF)长度为1 479 bp;推测编码的VdCAT1蛋白含492个氨基酸,相对分子量为56.96 kD,理论等电点(pI)为6.65,总平均疏水系数为-0.545;推测VdCAT1为无跨膜结构域、非分泌性亲水蛋白质。VdCAT1二级结构主要由随机卷曲和α-螺旋等构件组成。樟叶越桔VdCAT1基因编码的氨基酸序列与茶树CsCAT1和拟南芥AtCAT1等过氧化氢酶氨基酸序列具有较高的同源性和较近的亲缘关系。本研究结果为日后揭示VdCAT1基因的生理学功能及其表达调控机制提供科学依据。     

甘蓝型油菜BnAPX1基因的克隆与生物信息学分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种利用抗坏血酸作为电子供体的H₂O₂清除剂,在植物抵御逆境胁迫中起到重要作用。为进一步探究甘蓝型油菜APX1基因的功能,本研究通过RT-PCR法从甘蓝型油菜中克隆得到一条长度为753 bp的APX1 CDS序列,将其命名为BnAPX1。生物信息学分析表明,BnAPX1基因共编码250个氨基酸,相对分子量为27.546 14 kD,等电点为5.49,不稳定系数为36.73,属于稳定性蛋白;该蛋白的二级结构中无规则卷曲为42.00%,α-螺旋为39.20%,延伸链为10.40%,β-转角为8.40%;亚细胞定位预测结果显示该基因编码的蛋白位于过氧化物酶体中,其编码的蛋白没有跨膜结构,没有信号肽,属于非分泌蛋白。BnAPX1蛋白含有K+binding site、Substrate binding site、Heme binding site结合位点,属于植物过氧化物酶类似家族。     

奶牛乳房炎抗性相关基因Znf313的电子克隆与序列分析

电子克隆是基因克隆的新策略。利用一个患乳房炎奶牛外周血白细胞中差异表达的EST序列为信息探针进行电子克隆,根据电子克隆序列设计引物,以奶牛外周血白细胞cDNA为模板进行RT-PCR验证,PCR产物克隆入pGEM-T质粒载体,测序得到的序列已被GenBank收录（DQ010409）。该基因被命名为牛锌指蛋白313(Znf313)基因,开放阅读框1~693bp,推测编码230个氨基酸,预测其编码蛋白分子量为25.67kD,等电点6.90。     

甘蓝型油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)的克隆与真核表达载体的构建

根据已知的拟南芥甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH1)序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆出油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)全长。测序和分析结果表明,BnBADH-1的cDNA全长1506bp,编码一个包含501个氨基酸残基、分子量为55kD、等电点(pI)为5.16的假定蛋白质;核酸序列和氨基酸序列与拟南芥的同源性分别为90.24%和93.41%。利用片段两端的粘性末端酶切位点BamHⅠ和SacⅠ将cDNA片段连接在真核表达载体pBI121上;PCR鉴定表明,过量表达载体pBI121-BnBADH-1已成功构建,为下一步的基因功能分析做好了准备。     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

新疆雪莲rbcs基因的克隆及序列分析

为获得新疆雪莲Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶）小亚基基因,并对其序列进行生物信息学分析;从已建立的新疆雪莲cDNA文库中,随机挑取单克隆,采用通用引物M13扩增并测序,测序结果在NCBI网址进行Blast比对,结果发现了2个与rbcs基因同源的序列并命名为sikrbcs1和sikrbcs2;生物信息学分析表明：sikrbcs1基因包含l个540 bp的完整开放阅读框,编码179个氨基酸,sikrbcs2基因包含l个420 bp的完整开放阅读框,编码139个氨基酸。sikrbcs1基因编码的蛋白质的理论等电点是8.90,分子量为20.1042 kD,具有2个跨膜区域,sikrbcs2基因编码的蛋白质理论等电点是7.58,分子量为15.1093 kD,不具有跨膜区域。氨基酸多序列比对表明,Sikrbcs1与黄顶菊和向日葵的相似性最高,达到83.89%,Sikrbcs2与向日葵的相似性最高达到57.54%;系统进化树显示表明,sikrbcs1和sikrbcs2都与菊花亲缘关系最近。     

疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列克隆与分析

从已构建疣粒野生稻消减cDNA文库中随机挑取阳性单克隆经测序得到ESTs, 通过生物信息学分析, 选取与泛素结合酶具有同源功能的EST以RACE技术分离克隆到1个疣粒野生稻泛素结合酶基因的全长cDNA序列, 命名为OmE2 (Oryza meyerianaBaill. ubiquitin-conjugating enzyme, OmE2), 该序列长917 bp, 最大开放阅读框为528 bp, 编码的蛋白具有175个氨基酸, 该蛋白的分子量为19.31 kD, 理论等电点为9.32。OmE2蛋白与其他物种的泛素结合酶具有高度的一致性和相似性, 含有泛素结合酶活性位点的保守序列及半胱氨酸残基, 且具有3个跨膜结构域, 推测OmE2是一类泛素结合蛋白兼跨膜蛋白。经RT-PCR分析, OmE2基因是受白叶枯病病原菌胁迫诱导表达的, 是首次从野生稻中发现的可能参与疣粒野生稻胁迫信号传导和抗病应答反应的基因。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

茶树叶绿素合成相关基因克隆及在白叶1号不同白化阶段的表达分析

高等植物叶绿素的生物合成对其正常光合作用起关键作用。本文根据前期芯片杂交结果,采用RT-PCR和RACE技术克隆了3个茶树叶绿素合成相关基因,分别为谷氨酸-t RNA还原酶基因(Cs Glu TR)、叶绿素合酶基因(Cs Chl S)、叶绿素酸醋氧化酶基因(Cs CAO),对应的Gen Bank的登录号分别为HQ660371、HQ660370、HQ660369。序列分析表明,Cs Glu TR基因全长2165 bp,开放阅读框长1665 bp,编码554个氨基酸,推测的蛋白分子量约为60.6k D,理论等电点为8.78;Cs Chl S基因全长1463 bp,其中开放阅读框长1125 bp,编码374个氨基酸,推测的蛋白分子量约为40.5 k D,理论等电点为8.58;Cs CAO基因全长2146 bp,其中开放阅读框长1611 bp,编码536个氨基酸,推测的蛋白分子量约为60.8 k D,理论等电点为8.03。比对分析表明,3个基因编码的氨基酸序列与其他植物中同源基因的相似性均在70%以上。利用荧光定量PCR技术检测3个基因在不同白化阶段的表达,表明Cs Chl S和Cs CAO基因具有明显的表达协同性,它们在叶片中的表达量与叶片的颜色变化高度同步;而Cs Glu TR在白化叶片和正常叶片中的表达差异相对较小,同时在新生芽叶转绿过程中最先恢复正常表达水平。说明在白化叶片中,叶绿素的合成机制受到较大影响,叶绿素合成受阻导致的叶片内色素类物质含量降低或消失是叶片白化的直接原因。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

基于RNA-seq技术的水杉半胱氨酸合成酶基因的克隆分析

水杉(Metasequoia glyptostroboides)是世界著名的孑遗植物,但对其在分子水平研究的报道极少。为了获得与耐逆境胁迫有关的半胱氨酸合成酶基因,本研究以水杉原生种为实验材料,基于高通量转录组测序(high-throughput mRNA sequencing, RNA-seq)技术从全长转录组文库中克隆了一个半胱氨酸合成酶基因(MeGl-CSase),并对该基因作了进一步的生物信息学分析。结果表明,MeGl-CSase基因的全长cDNA为1 702 bp,编码长度为465个氨基酸的半胱氨酸合成酶蛋白;该蛋白的分子量为49 471.35 Da,总平均吸水值为-0.071,等电点为7.95;含有39个常见功能位点;二级结构包括11个折叠区、21个螺旋区以及一些卷曲区;三级结构预测结果进一步证明MeGl-CSase基因编码的产物是真核生物半胱氨酸合成酶蛋白。本研究结果可为水杉及其它物种的半胱氨酸合成酶蛋白基因的结构和功能研究提供参考。