北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累.为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列...     

白芨蔗糖转运蛋白基因BsSUT2的克隆和表达分析

蔗糖转运蛋白(SUTs)在介导蔗糖由源到库器官的长距离运输、植物生长发育以及抵抗逆境胁迫中发挥重要作用,研究白芨蔗糖转运蛋白BsSUT2的序列信息与表达模式,为揭示其蛋白结构及基因功能提供依据。基于白芨转录组数据,采用RT-PCR技术获得白芨Bs SUT2基因CDS全长,通过生物信息学软件分析Bs SUT2编码蛋白的分子特征,并对BsSUT2进行氨基酸序列比对与系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR技术检测BsSUT2基因的组织表达模式。结果表明,克隆获得的BsSUT2基因CDS全长为1 584 bp,编码527个氨基酸。BsSUT2蛋白包含12个跨膜结构域,亚细胞定位预测表明BsSUT2蛋白定位于质膜,与铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰SUT2基因编码蛋白序列一致性高,隶属于SUT4亚族。Bs SUT2基因的表达具有组织特异性,其转录本在白芨幼苗的假鳞茎中表达量最高。推测BsSUT2基因在白芨生长发育和蔗糖的分配中发挥重要作用。本研究对白芨BsSUT2基因的序列特征与组织表达模式进行分析,为阐明Bs SUT2基因在蔗糖运输与分配、生长发育和逆境胁迫中的功能提供实验数据支持。     

香樟FPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)的cDNA序列,并开展生物信息学分析,为香樟植物萜类物质的合成及调控机理研究提供基础。本研究利用香樟转录组的测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录PCR技术扩增获得香樟FPPS基因,经生物信息学分析,对该基因编码的蛋白进行表征。香樟FPPS基因的开放读码框(ORF)序列全长为1 053 bp,编码350个氨基酸,蛋白分子量为40.42 kD,理论等电点为5.25。香樟FPPS是一个定位于细胞质,不含信号肽的不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域并含有7个保守结构域,氨基酸序列二级结构主要为α-螺旋。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟CcFPPS的氨基酸序列与山苍子、陆地棉和野大豆等植物的FPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析表明,香樟CcFPPS蛋白与樟科植物山苍子FPPS蛋白的亲缘关系最近。本研究首次成功从香樟中克隆了CcFPPS基因并进行了生物信息学分析,为进一步研究CcFPPS基因在萜类合成调控的功能提供理论依据。     

白芨钙依赖蛋白激酶基因BsCDPK1克隆及组织表达分析

钙依赖蛋白激酶(CDPKs)在调节植物生长发育与逆境胁迫响应中发挥了关键作用,研究CDPK基因的序列信息与表达模式,为揭示蛋白结构、基因功能及参与的抗逆信号网络奠定基础。采用RT-PCR、RACE技术获得白芨BsCDPK1基因c DNA全长;利用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化特性和结构域等特征,并对BsCDPK1进行氨基酸序列比对与系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR技术对Bs CDPK1基因在白芨幼苗期的表达模式进行检测分析。结果表明,克隆获得的Bs CDPK1基因cDNA全长为1 981 bp,编码496个氨基酸,其编码蛋白相对分子质量为55.997 kD,理论等电点5.38,脂肪指数为87.50,不稳定指数为43.54。BsCDPK1蛋白包含CDPKs家族典型的激酶结构域、自抑制功能域、ATP结合位点以及C-端的4个EF-hand手性结构,并且高度保守;BsCDPK1与铁皮石斛、蝴蝶兰的CDPK基因亲缘关系最近,聚为一支。q RT-PCR结果表明BsCDPK1在白芨幼苗的根、茎、叶中均有表达。白芨BsCDPK1基因的克隆与序列特征分析、幼苗组织表达模式分析为阐明BsCDPK1基因在白芨生长发育和逆境胁迫中的功能奠定实验基础。     

白芨转录因子基因BsWRKY14的克隆与分子特性分析

WRKY转录因子在调节植物生长发育、抵抗生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用,分析WRKY家族成员的基因序列信息,为进一步研究基因功能提供前期研究基础。基于白芨转录组数据,对Bs WRKY14基因进行克隆;利用生物信息学方法对BsWRKY14蛋白的理化特征、保守结构域和亚细胞定位等特性进行分析,用DNAMAN和MEGA 6.0进行氨基酸多序列比对和进化关系分析。结果表明Bs WRKY14基因包含1个1 179 bp的开放阅读框,编码392个氨基酸,预测是定位在细胞核中的不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构域,BsWRKY14蛋白包含一个WRKY基因保守结构域和一个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅱ类成员;Bs WRKY14与铁皮石斛WRKY蛋白亲缘关系最近。白芨Bs WRKY14基因的克隆与分子特性分析为深入研究BsWRKY14基因在调节白芨生长发育和逆境胁迫响应中的作用提供数据支持。     

狗枣猕猴桃(Actinidia kolomikta)查尔酮合酶AkCHS1生物信息学分析

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮合成途径的关键酶和限速酶,在植物花色素苷形成中具有重要作用,并参与植物的育性、机械损伤的防御反应等。本研究利用生物信息学方法在RNA-seq数据中获得了狗枣猕猴桃查尔酮合酶基因(AkCHS1)的序列信息,并对AkCHS1进行结构及功能预测。结果表明,狗枣猕猴桃AkCHS1的c DNA全长为1577 bp,CDS为1167 bp,编码蛋白由389个氨基酸构成,具有CHS_like的保守序列,是查尔酮合酶(PLN03169)超家族的一员,是一个亲水性、稳定的蛋白。与其他19种植物的查尔酮合酶氨基酸序列进行对比,结果表明,狗枣猕猴桃AkCHS1与中华猕猴桃及其变种亲缘关系较近,而与桑树、柑橘等植物亲缘关系较远。本研究为狗枣猕猴桃AkCHS1基因功能的进一步研究提供了参考。     

陆地棉GhCYP1基因的分离及其表达分析

应用SSH-PCR技术,在筛选到抗旱相关基因的EST序列基础上,采用RACE技术,分离克隆到全长为801bp,含编码序列(CDS)为522 bp的棉花抗旱相关基因GhCYP1.氨基酸序列比对发现,该基因与拟南芥、水稻、人等的亲环蛋白基因高度同源,都具有由11个连续氨基酸所组成的单结构域亲环蛋白典型结构,且在保守区都具有...     

万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段的克隆及分析

为了研究万寿菊中玉米黄质生物合成途径的关键酶基因,首先根据不同物种的ZEP基因进行序列比对找到保守区域设计简并引物,然后利用RT-PCR方法,以万寿菊花瓣总RNA为模板克隆万寿菊ZEP基因cDNA的片段,并进行序列分析。结果表明,万寿菊ZEP基因片段长度为1 058 bp,编码352个氨基酸残基,其序列与其他植物ZEP基因同源性最大为92%;其翻译产物属于亲水性蛋白;且结构域预测结果发现TeZEP基因编码的氨基酸序列含有一个NADB_Rossmann超家族和玉米黄质环氧化酶的特征性结构黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合位点。本研究成功克隆了万寿菊玉米黄质环氧化酶TeZEP基因片段并对其进行了序列分析,这为进一步研究该基因功能提供了依据,也为构建转基因植物和沉默基因植株以提高玉米黄质合成量提供了一定的参考。     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

砂藓(Racomitrium canescens)RcRab基因的克隆及生物信息学分析

本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱处理转录组数据库中筛选获得小G结合蛋白基因Rab的mRNA序列,通过RT-PCR法扩增,得到RcRab基因的CDS序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该基因c DNA全长为1171 bp,包含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。预测该基因有Rab家族的保守结构域-G结构域。RcRab蛋白分子质量为23.29 kD,理论等电点为5.76,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。进化树分析表明,RcRab蛋白质与小立碗藓(Physcomitrella patens)Rab蛋白质亲缘关系最近。本研究可为进一步探索RcRab基因在苔藓植物中的抗旱机制提供数据基础。     

百脉根ACC氧化酶基因LcACO1的克隆及序列分析

植物激素乙烯参与植物生长发育多个生理过程的调控。ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键合成酶。本研究依据其它物种ACC氧化酶序列信息设计简并引物,并结合RT-PCR和快速扩增c DNA末端技术从牧草百脉根中首次克隆到ACC氧化酶基因的全长c DNA序列,命名为LcACO1。LcACO1全长c DNA为1 012 bp,具有一个924 bp ORF可编码307个氨基酸残基。生物信息学分析表明,LcACO1是含有Fe2+依赖的加氧酶结构域的稳定亲水蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与其它植物中的ACO蛋白进行同源性比对显示,LcACO1蛋白与鹰嘴豆中ACO蛋白的一致性高达90%。实时荧光定量PCR表明,LcACO1基因在百脉根不同组织器官中差异表达,根中表达量最高,推测其主要在根的生长发育调节方面发挥作用。     

漆树TvFAD2基因的克隆与表达分析

植物油酸脱氢酶基因(FAD2)编码的蛋白是负责催化油酸转化为亚油酸的关键脂肪酸去饱和酶,在植物发育、油品质改良及耐逆过程中发挥重要调控作用。为了分离漆树FAD2基因并研究其功能,本研究采用同源克隆法首次从漆树中获得了FAD2基因的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,TvFAD2基因的开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸,具有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。TvFAD2为亲水性蛋白,含有5个跨膜结构域和3个富含组氨酸的保守区域。系统进化树分析表明,漆树FAD2蛋白和盐肤木FAD2蛋白的亲缘关系最近。转录表达水平检测结果表明,TvFAD2基因在主要在漆树的叶和幼果中表达,在幼果中表达量最高,在花蕾期全花和盛花期全花中有低水平的表达。本研究为漆树FAD2基因的进一步利用提供了理论指导。     

白菜S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶BrSAMDC基因的克隆、表达及生物信息学分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)是生物体内亚精胺合成过程中的限速酶,在植物生长发育及抗逆境胁迫方面起到重要的调节作用。本研究通过RT-PCR技术从大白菜栽培种Chiifu-401中克隆得到一个BrSAMDC基因,并对其进行表达特性及其蛋白的结构与功能进行生物信息学分析。结果表明,BrSAMDC的cDNA扩增序列为1 566 bp,CDS区为1 107 bp,编码368个氨基酸。定量PCR结果显示,BrSAMDC基因在白菜的各个组织均有较高表达,其中角果中的表达量最高,其次为花、茎和根,而在叶片中的表达量最低。BrSAMDC蛋白分子量为40.52 kD,属于亲水、稳定蛋白;预测其分布于细胞核内,不存在信号肽和跨膜结构域;二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功。14种植物SAMDC蛋白的序列对比分析显示,均含有LSESSLF结构域和PEST结构域,且十分保守;十字花科的SAMDC蛋白同源性较高,且其氨基酸的进化与植物分化具有一致性。本研究为白菜SAMDC基因的功能研究及应用提供数据基础。     

拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。     

五节芒CCoAOMT和4CL的克隆和表达分析

木质素是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育和抵御病原微生物的侵害方面发挥着重要的作用,但木质素结构稳定,成为生物质能源转化的障碍。以五节芒(Miscanthus floridulus)为材料克隆得到了木质素合成过程中的关键酶CCoAOMT基因全长CDS序列和4CL基因的CDS半长序列,并对其CDS和氨基酸序列与其他物种进行了比对分析。相应的qRT-PCR分析显示,2个基因在五节芒的幼苗期、抽穗期的茎节、成熟叶片、幼穗都有表达,且与木质素的合成有一定的相关性。间苯三酚溶液染色结果亦显示,2个基因的表达规律与茎秆的木质化进程一致。五节芒CCoAOMT和4CL基因的克隆和表达分析将为进一步研究其生物学功能和改良能源作物奠定基础。     

油茶花青素还原酶基因克隆和体外功能研究

花青素还原酶(ANR)是催化花青素还原形成单体儿茶素的关键酶。油茶(Camellia oleifera Abel.)属于山茶科山茶属植物,其花青素还原酶基因尚未被克隆和功能分析。本研究采用RT-PCR技术,克隆获得了两条油茶花青素还原酶基因的全长序列,CoANR1基因全长1441bp,开放阅读框(ORF)长度为1047bp,编码348个氨基酸残基,与茶树ANR1基因的蛋白序列同源性为97%;CoANR2基因全长1413bp,ORF框长度为1014bp,编码337个氨基酸残基,与茶树ANR2基因的蛋白序列同源性为99%。采用大肠杆菌表达方法获得CoANR1和CoANR2重组蛋白,纯化蛋白经体外酶活检测能够催化矢车菊色素合成儿茶素(C)和表儿茶素(EC),催化飞燕草色素合成没食子儿茶素(GC)和没食子表儿茶素(EGC)。本研究为进一步研究油茶儿茶素合成的分子机制提供了重要的研究基础和理论依据。     

马铃薯晚疫病菌应答WRKY基因的结构功能预测与植物表达载体构建

WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。采用RT-PCR技术获得该基因CDS全长,并对其进行序列分析及结构功能预测。根据StWRKY蛋白序列进行同源性搜索,得到与其蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列,使用MEGA7软件对St WRKY蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建了系统进化树。利用在线工具ProtParam对StWRKY进行氨基酸理化性质分析;利用SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用SWISS-MODEL在线工具和PredictProtein在线平台分别对StWRKY蛋白二级结构和三级结构进行分析。结果表明,StWRKY核苷酸序列CDS全长为957 bp,编码含318个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量为36.17 k D,等电点为6.49。既不是分泌蛋白也不是膜蛋白,未发现跨膜区、信号肽和复合螺旋区。StWRKY三维空间结构主要由无规卷曲以及β-折叠组成。通过XcmⅠ酶切、连接将StWRKY装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-StWRKY。StWRKY基因的克隆,为进一步从分子水平上验证其抗晚疫病的生物学功能以及揭示马铃薯生物胁迫抗逆机制奠定基础,并为马铃薯抗病育种提供新的基因资源。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析

根据已发表的植物β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长,命名为PR34,该基因全长序列为1416bp,具有一个编码335个氨基酸的开放阅读框(ORF),其起始密码子ATG位于13bp处,终止密码子TAG位于1015bp处,3'末端有20bp的poly(A)尾,379bp的3'非翻译区。与GenBank中小麦、大麦等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性;对其推断的氨基酸序列进行分析,含有Glyco_hydro_17保守结构域,为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。Southern杂交显示,该基因在TcLr35小麦基因组中为低拷贝。