甘薯病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为了快速进行甘薯病毒田间检测和脱毒苗诊断,该研究建立了一个能够同时检测SPCSV、SPLV和SPFMV这3种病毒的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank公示的甘薯病毒基因序列来设计3种甘薯病毒的引物,分别对模板浓度、退火温度、Mg2+浓度和循环次数进行优化,同时对模板浓度进行10倍梯度稀释,检测多重RT-PCR灵敏度。结果显示,模板浓度为19 ng/μL、退火温度为52℃、Mg2+浓度为0 mmol/L、循环次数为40次时,可以同时扩增出大小为276 bp、570 bp、425 bp三种病毒的基因片段,多重RT-PCR检测灵敏度为10-4,单一RT-PCR检测灵敏度为10-3,多重RT-PCR检测灵敏度是单一RT-PCR的10倍。该研究使用优化的多重RT-PCR检测技术可获得稳定、灵敏、准确、高效地和同时地检测田间复合侵染的3种甘薯病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量,建立IBV的Real-time RT-PCR方法.用RT-PCR方法扩增出IBV的N基因片段,并克隆到pEASY-T3载体中,构建成含有N基因片段的重组质粒.应用该重组质粒进行SYBR Green I Real-time PCR,建立了定量检测IBV核酸的标准曲线与直线回归方程,该方法显示:特异性强,检测下限至少达到5.58× 102拷贝/μL,其重复性试验的变异系数小于3.2％;用建立的方法对实验接种IBV M41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测,检测结果显示:攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏,支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、10天,并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系.研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于IBV的定量检测.     

猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本。     

接种和检测苹果潜隐病毒

通过试管微嫁接，分别将苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒接种到小金海棠组培苗上，并用PAS—ELISA法检测其带毒率。结果表明：接穗小金海棠苹果褪绿叶斑病毒的带毒率为60．0％，其苹果茎沟病毒带毒率为73．3％，从而证明用此方法可以对组培苗进行快速病毒接种而得到带毒的实验材料。     

禽流感病毒RT-PCR ELISA诊断方法的建立

针对A型禽流感（AI）保守的M基因设计引物,并分别用地高辛和生物素标记,建立检测A型AIV的RT-PCRELISA方法。试验主要对RT-PCRELISA的各种反应条件进行了优化,确定了2mg／mL的链霉亲和素包被、1：3000抗地高辛的过氧化物酶及孵育时间等最适反应条件。该方法的敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上,而且特异性强,克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难,为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。     

兰花上凤仙花坏死斑病毒和建兰花叶病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot vjrus,INSV)和建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)的保守序列设计特异性引物,建立了双重RT-PCR同时检测两种病毒的方法.用该方法对兰花基地的可疑发病兰株进行检测,结果从田间采取的12株可疑兰花中有6株检出INSV,1株检出CyMV,2株同时检出两种病毒.     

RT-PCR检测甜菜坏死黄脉病毒及总RNA提取方法研究

为选择较为适合甜菜总RNA的提取方法,构建和优化RT有效体系。以田间甜菜叶片、根毛及根表皮为材料,研究了提取甜菜总RNA的方法以及利用RT-PCR技术进行甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的检测。研究表明,获得良好的RT-PCR扩增效果,RT体系中dNTPs浓度、引物、AMV、模板RNA的浓度要分别达到1 mmol/L,1μmol/L,0.1 U/μL,0.01μg/μL较好。PCR体系中dNTPs浓度、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2 的浓度要分别达到0.1 mmol/L,0.1μmol/L,0.01U/μL,1.48 mmol/L效果较好。RT-PCR法对BNYVV检测,可作为甜菜品种(育种材料)早期抗丛根病性鉴定的依据之一。     

三种百合种球病毒RT-PCR检测

本研究以4个百合品种为试材进行种球病毒分子生物学检测。研究结果表明,通过设计兼容性好、性状稳定的三对特异性引物,提高了PCR扩增的效率,改良了RNA的提取方法;改进Trizol法使其适合于内层鳞片及脱毒苗叶片总RNA的提取,而中外层鳞片则采用改进的CTAB法,得到高纯度、高质量以及完整度好的RNA;各反应成分的扩增条件得到了优化,建立了灵敏、快速、低成本的种球病毒RT-PCR检测反应体系及程序。     

利用RT-PCR对黄瓜病毒病毒原种类进行检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶序列和西瓜花叶病毒2号(WMV-2)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜绿斑花叶病毒(CGMMV)的外壳蛋白基因序列以及南瓜花叶病毒(SQMV)的运动蛋白序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增。对2002～2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果表明,天津地区黄瓜主要毒原种类有CMV,WMV-2和TMV,感染率分别为样本数的96．94％,77．55％和38．67％,CMV和WMV-2 2种病毒的复合感染率为76．53％,3种病毒的复合感染率达到14．67％。     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究。结果表明：以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA。设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带。构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%。用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据。     

应用免疫捕获RT-PCR检测槟榔APV1病毒

槟榔黄化病的蔓延已经严重威胁海南的槟榔种植业,其病原被鉴定为APV1 (Areca palm velarivirus1)病毒。为了提高APV1病毒检测的效率及灵敏度,本研究拟采用免疫捕获RT-PCR (IC-RT-PCR)对APV1病毒进行检测。首先制备APV1病毒外壳蛋白的单克隆抗体,然后将抗体包被PCR管,加入槟榔黄化叶片或者与APV1病毒虫媒粗提取液进行免疫捕获,最后进行RT-PCR检测。研究结果显示,IC-RT-PCR对槟榔黄化病叶片样品中APV1病毒的检测灵敏度比普通RT-PCR高2 500倍,对粉蚧样品中APV1病毒的检测灵敏度比普通RT-PCR高125倍。IC-RT-PCR避免了RNA提取的环节,检测效率提高,且检测灵敏度更高,对检测的浓度样品具有巨大技术优势。本研究结果为APV1病毒的检测提供技术支撑。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立及初步应用研究

为建立一种特异、敏感的PEDV的检测方法。根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒CV777株的M基因序列,设计了一对特异性引物,扩增长度为680 bp的片段。将PCR产物进行测序,与CV777株、SH5株M基因的同源性分别为99.2%和97.6%。试验表明：该方法具有较好的特异性和敏感性,并能检测到PEDV的RNA浓度下限为100 pg/μL。从福建省的3个地区共采集58份哺乳仔猪腹泻样品,并应用此方法进行检测,其阳性检出率为87.9%。     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究.结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA.设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带.构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%.用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据.     

侵染怀玉山三叶青的病毒RT-PCR鉴定

三叶青一般通过无性繁殖,极易感染病毒,造成其种性退化。为了探明三叶青携带病毒的种类,为其病毒病防控及病毒脱除提供科学依据,本研究在三叶青转录组和葡萄病毒序列的基础上,通过RT-PCR技术对怀玉山三叶青15种病毒(烟草花叶病毒,葡萄扇叶病毒,葡萄茎痘伴随病毒,葡萄卷叶病毒-1,葡萄卷叶病毒-2,葡萄卷叶病毒-3,葡萄卷叶病毒-4,葡萄卷叶病毒-5,葡萄卷叶病毒-6,葡萄卷叶病毒-7,葡萄卷叶病毒-9,葡萄病毒A,葡萄病毒B,葡萄病毒E,葡萄病毒F)进行RT-PCR验证。结果表明,怀玉山三叶青只检测出烟草花叶病毒,其他14种病毒没有检测到。本实验结果首次检测出了三叶青的主要病毒种类,可为三叶青脱毒苗的培育及其工厂化生产提供理论依据。     

水仙花叶病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

旨在建立水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus,NMV)的分子快速检测方法。根据已公布的NMV基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性及实际检测效果进行测定。从感染NMV的水仙样品中成功扩增出预期大小（约483 kb）的特异性目的片段,而健康水仙上未扩增到相应的片段。特异性、灵敏度及重复性测定结果表明,本研究建立的RT-PCR方法特异性强、灵敏高、重复性好。应用该方法成功检测了一批口岸送检的水仙样品。本研究建立的RT-PCR方法可为水仙上NMV的检测提供可靠的技术支持。     

脱病毒对甘薯产量和生长发育的影响

探讨了脱病毒对甘薯不同品种产量和生长的影响。结果表明：脱病毒甘薯光合速率大,光合产物积累多;生育后期,主茎粗,有较好的运输系统,Ｔ／Ｒ植结构合理,光合产物分配合理,地下部薯块膨大早,大中薯率高,具有较好的增产潜力。其中皖薯３号脱病毒的效果更好。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立快速检测猪血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）的RT-PCR方法,根据GenBank中HEV的HE基因和S基因设计了1对引物,在优化RT-PCR反应条件的基础上,成功的扩增出323bp的特异性条带。检测与HEV亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性,最低可以检测到10个TCID50/100μl的病毒,说明该方法的有较好的特异性和敏感性。用此RT-PCR方法对感染HEV的小鼠和猪进行检测,结果能从发病动物的多种组织中检测到病原,其中以脑组织的检出率最高。因此,临床疑似病例检测时以脑组织为最佳检测样本