4种食源性致病菌多重PCR检测技术的研究及应用

为建立一种利用多重PCR技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的方法,根据沙门氏菌侵袭力蛋白A基因(invA gene)、单核细胞增生李斯特菌蛋白转录调控基因(prfA gene)、金黄色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蜡样芽孢杆菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB gene)设计引物,进行多重PCR扩增,并对多重PCR反应体系进行优化。在此基础上建立了4种致病菌的多重PCR检测体系,同时以国标法进行对比验证。结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,具有很好的应用前景。     

应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究

采用PCR技术,通过扩增蜡样芽胞杆菌的gyrB基因来实现对蜡样芽胞杆菌的快速检测。结果表明,以gyrB为目的基因设计引物建立的PCR检测方法能特异性地扩增出蜡样芽胞杆菌,且与其他芽胞杆菌菌株均无交叉反应,其检测敏感性可达9 cfu/mL,能够应用于蜡样芽胞杆菌的鉴定。     

山鸡椒酒精浸提液对体外细菌的抑制对比研究

山鸡椒酒精浸提液对大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等4种细菌的抑制试验结果表明:山鸡椒酒精浸提液对这4种细菌都有非常强的抑制作用,且抑制的效果随着酒精浓度的降低逐渐降低。其中,对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好,蜡样芽胞杆菌次之,大肠杆菌第三,痢疾杆菌最差。对抑制时间的研究结果表明,山鸡椒酒精浸提取液对大肠杆菌起杀菌作用,对金黄色葡萄球菌抑制时间最长,蜡样芽胞杆菌次之,痢疾杆菌最短。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱快速鉴定蜡样芽胞杆菌研究与应用

建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术针对食源性蜡样芽胞杆菌快速鉴定方法。以蜡样芽胞杆菌模式菌株为研究对象,优化该菌样品处理方法,并选取17株蜡样芽胞杆菌标准菌株补充MALDI-TOF-MS数据库,探讨方法灵敏度、稳定性和准确性。结果表明,蜡样芽胞杆菌最佳样品处理方法是甲酸提取法,数据库补充可提高该菌鉴定可信度,MALDI-TOF-MS鉴定方法准确度高、稳定性好,灵敏度为104cfu并通过聚类分析分型。研究确定的MALDI-TOF-MS鉴定方法准确快速,可为食源性蜡样芽胞杆菌快速鉴定和分型提供技术支持。     

蜂胶提取液对鸡蛋保鲜的效果

采用水、95%乙醇及其分别与超声波的综合作用从原蜂胶中提取蜂胶液,将得到的蜂胶提取液稀释成8、4、2、1mL/L,并分别对蜡样芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行抑菌圈直径和最小抑制浓度(MIC)的测定,选取提取效果最好方法中的两个浓度进行鸡蛋保鲜效果试验。结果表明,超声波作用于95%的乙醇蜂胶液的方法提取效果最好;不同提取方法得到的蜂胶提取液的抑菌作用存在差异,以超声波和乙醇提取的蜂胶液对受试菌作用最强;蜂胶提取液对大肠杆菌的抑制作用最强,其次是沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌;在鲜蛋保鲜试验中发现,两种浓度、两种方法均有不同程度的保鲜效果。     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。     

浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立

根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.     

正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Toq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16（4^4）优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3．5×10^2 cfu／ml、沙门氏菌为2．2×10^2 cfu／ml、志贺氏菌为1．0×10^2 cfu／ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。     

同时检测四种病原菌的PCR方法研究

(目的)为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法.(方法)本研究针对大肠杆菌的(16s-23s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nuc)基因、单增李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成了四对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484 bp、372 bp、284 bp,并对多重PCR反应条件进行了优化.(结果)建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点,检测时间为4h左右.(结论)为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了基础.     

山东省市售畜禽肉蛋产品中食源性致病菌污染状况分析

为了解山东省市售畜禽肉蛋产品中食源性致病菌的污染状况,我们于2017年在山东省德州、临沂、济宁3地市采集畜禽肉蛋样品,共计8类360份样品,并对其中常见食源性致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、空肠弯曲杆菌)的污染状况进行分析。结果表明,360份畜禽肉蛋产品中,4种食源性致病菌检出率为40.8%(147/360)。其中,空肠弯曲杆菌在猪肾中检出率最高,为53.8%(7/13);金黄色葡萄球菌在猪肉和牛肉中检出率最高,分别为26.7%(24/90)和26.7%(8/30);沙门氏菌在猪肝中检出率最高,为5.9%(1/17);大肠杆菌O157均未检出。综上,山东省市售畜禽肉蛋产品中污染的食源性致病菌主要以空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌为主,建议相关部门针对性加强对畜禽蛋产品市场的监管及风险监测工作。     

猪肉及其制品中几种病原微生物芯片检测方法的建立及应用

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌检测的基因芯片方法,并在实际应用中检测芯片的效果。[方法]以5种目标菌保守基因片段为模板设计引物,用待检样品增菌后提取的DNA模板进行2个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交,用芯片扫描仪对芯片杂交结果进行扫描并判定结果。[结果]使用基因芯片检测5种细菌的检测下限分别为：金黄色葡萄球菌8.7×105cell/ml;大肠杆菌O157：H7 5.0×105cell/ml;沙门氏菌4.4×105cell/ml;单增李斯特氏菌2.4×105cell/ml;空肠弯曲杆菌6.2×106cell/ml。[结论]与传统方法比较,芯片法具有较高的特异性和灵敏性,是一种能应用于实际的快速高通量检测细菌的方法。     

PCR法检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

[目的]建立一种快速准确检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。[方法]将金黄色葡萄球菌模拟污染的水增菌后提取菌体DNA,以沙门氏菌、大肠杆菌DNA和空白作对照,用PCR法扩增金黄色葡萄球菌肠毒素A基因。[结果]金黄色葡萄球菌DNA的检测结果呈阳性,检测底限达100 cfu/L,而大肠杆菌和沙门氏菌及空白对照均未出现特异性片段,整个检测过程只需要24 h。[结论]试验建立的PCR方法可检测水及类似食品中的金黄色葡萄球菌SEA基因,并具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的特点。     

Development of a Multiplex PCR for Diagnosis of Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Bacillus cereus from Cows with Endometritis

Staphylococcus aureus,Escherichia coli and Bacillus cereus are the major agents of cow endometritis in dairy cows.A multiplex PCR (SEB-mPCR) was established based on the conserved genes of S.aureus,E.coli and B.cereus,and the detection limits were 103,102 and 103 CFU mL-1,respectively.SEB-mPCR could not amplify genomic DNA of pathogenic bacteria of other common bovine diseases.A total of 309 vaginal discharge samples from cows with endometritis were tested by SEB-mPCR.Of the samples,23.95％ had the three kinds of bacteria detected,17.15％ had S.aureu and E.coli,9.39％ had E.coli and B.cereus,and 9.71％ had S.aureus and B.cereus.The rates of infections with S.aureus,E.coli and B.cereus were 11.35,16.18 and 9.06％,respectively.Therefore,SEB-mPCR has a potential as a diagnosis tool for endometritis in dairy cows.     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex　PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。     

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定.     

海芦笋黄酮化合物抑菌效果研究

研究海芦笋黄酮化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌的体外抑制效果。结果表明,海芦笋黄酮化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、副溶血弧菌的抑制效果良好,而抑菌效果为：大肠杆菌〈沙门氏菌〈枯草芽孢杆菌〈副溶血弧菌〈金黄色葡萄球菌。     

羊流产衣原体的PCR检测方法研究

根据羊流产衣原体16SrRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼衣原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的卵黄囊膜均未扩增出相应的片段。敏感性试验表明,该体系可检测到2pg的衣原体DNA。