TaqMan实时荧光PCR快速检测与鉴定单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品

利用TaqMan 实时荧光PCR 技术对单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品进行快速鉴定和验证。依据GB 4789 系列标准的第一法对ACAS-PT526 能力验证中的样品D15 和样品D16 进行检测,通过增菌、分离、初筛和鉴定等传统培养法检测。鉴定过程中还使用了鉴定试剂条API Listeria 和全自动微生物鉴定系统。同时采用TaqMan 实时荧光PCR 技术对经过增菌的样品D15 与样品D16 的培养物和单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株的培养物进行快速鉴定。结果表明,经API Listeria 试剂条鉴定,样品D15 为单核细胞增生李斯特氏菌,鉴定百分率为98.6%,T 值为1;经全自动微生物鉴定系统检测,样品D15 为单核细胞增生李斯特氏菌,99%可能性;样品D16 为金黄色葡萄球菌,99%可能性;经实时荧光PCR 鉴定,样品D15 LB1 增菌液培养物及李斯特显色培养基平板上的单菌落都具有显著的S 型扩增曲线。综上得出,实时荧光PCR 与GB 4789.30—2016 的第一法试验结果一致,样品D15 为单核细胞增生李斯特氏菌检出,样品D16 为单核细胞增生李斯特氏菌未检出,TaqMan 实时荧光PCR 方法可用于微生物的快速检验,尤其是对盲样检测的辅助验证。     

单核细胞增生李斯特菌生物学毒理特性及防控方法研究进展

单核细胞增生李斯特菌是一种能引起人畜共患的食源性致病菌。人们食用被单核细胞增生李斯特菌污染的食物后能引起李氏杆菌病,会导致胃肠炎、脑膜炎、败血症等疾病。与其他食源性疾病相比,单核细胞增生李斯特菌具有较高的致死率,可达20%～30%,严重阻碍了食品工业的发展。因此,对单核细胞增生李斯特菌的研究日益受到人们的关注。对单核细胞增生李斯特菌的生物学特性、流行病学、主要毒力因子和防控方法进行综述,为单核细胞增生李斯特菌的研究提供理论依据。     

单核细胞增生李斯特菌 sRNA 伴侣分子 hfq的基因克隆、表达及纯化

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a（＋）中,成功构建pET-32a（＋）-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示：克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

分子伴侣hfq基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力及生物被膜生成的影响

为了解非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)分子伴侣蛋白Hfq在LM毒力中发挥的调控作用,在构建LM-Δhfq缺失株的基础上,通过动物攻毒试验检测野毒株LM-SB5与缺失株LM-Δhfq对昆明系小鼠的LD50,肝、脾载菌量及对肝、脾、肾的病理损伤;通过溶血试验检测二者的溶血活性;通过结晶紫染色的方法检测二者的生物被膜生成能力。以分析hfq基因缺失对LM毒力及生物被膜生成的影响。结果显示,与LM-SB5相比,LM-Δhfq对小鼠的LD50升高了6.067倍,毒力显著降低;肝、脾载菌量在第2,4,5天显著下降(P0.05),在第3天下降极显著(P0.01);对肝、脾、肾的病理损伤也有所减弱,LM-Δhfq较LM-SB5溶血能力下降了2倍,生物被膜生成能力在24 h时显著降低(P0.05)。研究结果证实,Hfq蛋白对LM的毒力及生物被膜生成能力具有重要调控作用。     

单核细胞增生李斯特菌新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的克隆、序列分析及其编码蛋白结构预测

为了解单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes LM.)新疆野毒株XS5 SigmaB操纵子的分子生物学特征。对LM-XS5的SigmaB操纵子部分基因序列进行了克隆与序列分析,预测该操纵子各基因编码蛋白质的二三级结构及功能活性位点,分析其同源性。结果表明：成功扩增出3000 bp的SigmaB操纵子片段,序列分析显示该片段中包含RsbV、RsbW、RsbX和SigmaB 4个基因,它们编码的蛋白质含有不同的功能活性位点,其中RsbV的5~102位AA为“STAS-抗-抗-SigamB因子”,RsbW的43~157位AA间为HATPase_c功能域,RsbX的32~198位AA间为PP2Cc超家族区域,SigmaB的8~264位AA为RNA聚合酶全酶中的SigmaB因子的区域。LM-XS5与其他3种革兰氏阳性菌的SigmaB基因的同源率在50%左右,与LM参考株的同源率在92.18%~100%之间。     

锦鲤疱疹病毒病病原检测能力验证结果分析

为了提高中国锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病原检测的整体水平,加强相关实验室检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的能力,2014—2016年开展了3次能力验证项目。能力验证样品为盲样,使用鲤鱼组织匀浆液,与包含了KHV TK基因片段和Sph基因片段的2种重组质粒溶液混合制成。对盲样进行了均匀性和稳定性检测。采用水产行业标准《鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒》(SC/T 7212.1-2011)中,推荐使用的聚合酶链式反应(PCR)方法进行病毒检测,并对各参加单位锦鲤疱疹病毒的检测结果进行分析。2014年能力验证第一轮测试结果满意率为58%,第二轮满意率为96%;2015年能力验证第一轮测试结果满意率为77%,第二轮满意率为89%;2016年能力验证第一轮测试结果满意率为82.69%,第二轮满意率为92.73%。通过2014至2016年的能力验证活动,大多实验室具备了锦鲤疱疹病毒PCR检测能力和质量管理水平,可以承担锦鲤疱疹病毒的检测和监测工作。     

提高发芽试验能力验证结果满意度的建议

根据2014年全国农作物种子质量检验机构发芽试验能力验证结果,阐述如何提高种子发芽试验能力验证结果的满意度,保证检测数据的准确性,进而提高种子发芽率的检测水平。     

ACAS-PT404(2017)奶粉中总砷的测定能力验证结果分析

通过参加实验室比对的能力验证活动,对实验室检测能力进行综合性考核。2017年4月,中心参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的奶粉中总砷的测定能力验证计划,通过电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光度法2种不同的方法进行结果验证,最终得出奶粉中总砷的含量为0.27 mg/kg,结果满意。     

确保竹笋中2种有机磷农药残留能力验证结果满意的关键点

针对如何保证农产品农药残留能力验证试验结果满意,需要把握好哪几个关键点进行探讨分析。通过竹笋中农残的能力验证,样品前处理采用NY/T 761的方法,必须注意:提取液的过滤要用定性滤纸或脱脂棉,提取液过滤后静置时间控制在30~40 min,吸取10 mL乙腈液体时要准确,净化步骤的水浴温度要严格按照方法要求的温度,氮吹切记不要吹的太干,最后定容5 mL要准确。检测结束后,对结果进行验证,并采用盲样的空白基质加标和盲样空白基质配的方法,分析判断结果准确性,得出真值,上报能力验证结果,1个月后有Z值反馈,结果为满意。     

冷链即食食品中李斯特菌的污染及防治措施

介绍了冷链即食食品的种类、生产和消费情况。李斯特氏菌是引起冷链即食食品腐败的常见污染菌,通过对李斯特氏菌生活习性分析,了解其生长特点,通过对加工设备、清洁、人员、运输等条件的改变或干预,切断李斯特氏菌的污染源,保证加工或运输的冷链即食食品的安全。     

冷鲜五花肉中假单胞菌预测模型的建立与验证

为了建立冷鲜五花肉中假单胞菌的生长预测模型,采用选择性培养基CFC琼脂对假单胞菌进行平板计数。利用Gompertz模型拟合0℃、5℃、10℃、15℃和20℃下冷鲜五花肉中假单胞菌的生长曲线,得到假单胞菌生长预测一级模型;生长预测二级模型以平方根模型、Arrhenius模型拟合一级模型中所得动力学参数。结果表明：一级模型中回归系数R2>0.99,准确因子(Af)、偏差因子(Bf)都接近1.0,延滞期(LPD)1.6996~0.1212,最大比生长速率(U)0.5782~3.3751。二级模型中平方根模型对延滞期和最大比生长速率回归系数R2为0.9825和0.934均略高于Arrhenius模型。可用平方根预测0~20℃范围内假单胞菌的变化情况,为冷鲜五花肉中腐败微生物的预测研究提供基础。     

FAPAS能力验证样品中重金属的测定

分析化学检测实验室参与食品分析水平评估计划(Food Analysis Performance Assessment Scheme,FAPAS)国际比对计划结果,探讨能力验证工作中的有效质量控制措施。通过总结化学检测工作中的部分经验,重点分析了在FAPAS能力验证中重金属测定的关键点,并就提高实验室的检测水平、加强质量控制有效性及确保能力验证判断结果的准确性等进行了讨论。     

燕麦中菌落总数检测能力验证研究

为了了解福建省福清市食品企业菌落总数检测能力,福清市质量技术监督局组织实施了燕麦中菌落总数检测能力验证工作,福清市45家实验室参加了本次能力验证。介绍了燕麦中菌落总数能力验证计划的实施过程,包括方案设计、样品设备、均匀性稳定性实验、结果统计能力评价,并对能力验证结果进行了技术分析和技术建议。结果表明,菌落总数检测满意结果率88.9%,参加能力验证的绝大多数企业能准确检测菌落水平,福清市食品企业的菌落总数检测人员具有较高的水平。出现可疑结果和不满意结果的企业多数是饮用水企业,应加强饮用水企业的出厂检验监管。     

黄曲霉毒素B_1检测能力验证分析

为确保实验室对黄曲霉毒素B1实验项目的检测能力,保证检测结果的可靠性,实验室在CNAS认可周期内参加了黄曲霉毒素B1能力验证活动。对能力验证的定义、目的、实施过程、统计方法及结果评价进行了介绍,并对黄曲霉毒素B1能力验证的测量结果进行了不确定度分析。黄曲霉毒素B1能力验证Z比分数为ZA=0.18、ZB=-1.35,能力验证获得满意结果。结果表明我中心黄曲霉毒素B1实验数据准确、可靠,CNAS认可项目有效。     

国内外水产品药物残留检测能力验证比对分析与发展建议

为进一步促进中国水产品药物残留检测能力验证的发展,提高中国水产品药物残留检测能力验证的水平、促进国际及国内各部委间组织的能力验证互认,笔者概述了国际著名权威机构FAPAS、APLAC及国内CNCA、中国合格评定委员会(CNAS)、中国检科院测试评价中心(ACAS)、农业部等对水产品药物残留检测能力的验证情况,比对分析了中国与国际权威机构在能力验证考核项目、样品制备方法、检测方法要求、结果反馈等方面的差异,并针对中国在水产品药物残留检测能力验证方面存在的问题提出了加强新参数项目研究、丰富样品制备考核手段、改进结果评定方法、加强技术交流等建议,以期为完善中国水产品药物残留检测能力验证活动提供参考。     

食品能力验证样品中沙门氏菌的分离及鉴定

结合自身参加食品沙门氏菌能力验证的经历,总结能力验证中沙门氏菌分离与鉴定的关键点,并就如何提高沙门氏菌乃至整个实验室的检测水平进行讨论。     

农作物种子转基因成分检测能力验证样品制备技术分析与总结

能力验证是评价检验机构技术水平和质量控制的重要手段,对近年来陕西省农作物种子检验站承担的各项转基因成分检测能力验证样品的制备工作进行回顾,总结了在能力验证样品制备工作中获取的经验与教训,分析了样品制备工作中一些好的做法和存在的问题,并提出了进一步改进的建议,为能力验证样品制备工作更为科学、规范地开展提供参考。     

种子企业能力验证活动中存在的问题及对策

<正>1种子企业能力验证活动的作用及现状针对我国种子企业开展能力验证活动的作用及现状,本文分析了开展能力验证工作可能遇到的问题,并针对能力验证活动提出建议。能力验证是利用实验室间比对来判定实验室能力的活动。能力验证体系在很多领域已经逐步成型,但我国种业实验室能力验证活动起步较晚,还未能引起大家的足够重视,能力验证在种业实验室领域的应用还有待深入研究和完善。