牛消化道各段Ⅰ型肽载体(bPepTI)mRNA表达量的比较研究

旨在比较研究牛消化道各段牛Ⅰ型肽载体(bPepTI)mRNA的表达。本研究分别用比较Ct和标准曲线2种相对定量方法和1种绝对定量方法比较牛各段消化道上皮黏膜I型肽载体mRNA的表达量,以了解小肽在牛消化道的主要吸收部位。比较Ct法测定牛各段消化道表达量无显著统计差异(P>0.05),数值上由大到小的顺序为:空肠、回肠、盲肠、十二指肠、瘤胃、结肠、皱胃、瓣胃、网胃;标准曲线法结果表明,牛消化道各段bPepTI mRNA表达量差异显著(P<0.05),其中空肠的表达量最高,显著高于回肠(P<0.05),回肠表达量与消化道其余组织差异显著(P<0.05),其余各组织间表达量差异不显著(P>0.05);绝对定量检测到牛消化道各部位bPepTI mRNA表达量总体差异显著(P<0.05),mRNA拷贝数由高到低依次为空肠、瓣胃、网胃、瘤胃、盲肠、十二指肠、回肠、皱胃、结肠,空肠的表达量显著高于瓣胃(P<0.05),盲肠、十二指肠、回肠、皱胃之间表达量差异不显著(P>0.05)。综合本研究结果,标准曲线法和绝对定量测定牛消化道I型肽载体mRNA表达量更为准确,在牛整段消化道中I型肽载体mRNA在空肠、回肠、瓣胃、瘤胃都有高表达,应是小肽吸收的主要部位。     

应用RT-PCR方法检测牛消化道各段Ⅰ型肽载体mRNA差异表达的研究

已有的研究表明,消化道可以小肽的形式吸收氨基酸,但尚未很好地确定小肽的主要吸收部位。我们在另一项研究中对牛Ⅰ型肽载体(BPepTⅠ)第3~10结构域1566bp片段序列进行了测定(Genebank登录号:DQ309694),与绵羊相同区域片段序列同源性高达96.04%。本研究以BPepⅠ测序结果为基础,并参考绵羊的部分序列设计了跨内含子引物,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定了牛离体各段消化道黏膜或上皮组织BPepTⅠ的相对表达水平,以评估小肽在牛消化道的主要吸收部位。以持家基因β-actin为参比基因,结肠样品为校正样品(其相对表达量2-△△CT值为1),研究结果表明:在整段消化道中,BPepTⅠ的相对表达量(2-△△CT值)由高到低依次为回肠(30.62)、空肠(26.12)、瓣胃(22.61)、瘤胃(16.17)、十二指肠(11.97)、网胃(5.18)、皱胃(3.22)、盲肠(1.13)和结肠(1.00)。各段消化道BPepTⅠ相对表达量差异显著(P<0.05),其中回肠相对表达量与空肠和瓣胃差异不显著(P>0.05),与瘤胃、十二指肠、网胃、皱胃、盲肠、结肠差异显著(P<0.05);空肠相对表达量与瓣胃、瘤胃、十二指肠差异不显著(P>0.05),与网胃、皱胃、盲肠、结肠差异显著(P<0.05);网胃、皱胃、盲肠、结肠的2-△△CT值均在5.2以下,相互之间相对表达量的差异不显著(P>0.05)。由BPepTⅠ基因相对表达活性可以将牛的各段消化道分为3组,回肠、空肠、瓣胃的活性最高,其次为瘤胃和十二指肠,网胃、皱胃、盲肠、结肠则;。     

驯鹿β-防御素-1(reBD-1)mRNA在驯鹿组织器官中的表达检测

为了检测reBD-1 mRNA在驯鹿体内可能的表达器官,研究根据已知的reBD-1 cDNA序列设计了一对预计扩增产物为121 bp的引物,以驯鹿舌、食管、瘤胃、网胃、皱胃、十二指肠、回肠、结肠、肝、肺、气管、肾、膀胱、睾丸、附睾、心脏、脾脏中提取的总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)技术检测驯鹿的上述器官内reBD-1 mRNA的表达情况.结果显示:reBD-1 mRNA在上述组织器官中均有表达,其中在舌、瘤胃、睾丸中表达最强;在食管、十二指肠、结肠、气管、脾脏中有中等量的表达;在网胃、皱胃、回肠、肝、肺、肾、膀胱、附睾、心脏内的表达较弱.β-防御素reBD-1在驯鹿体内的广泛表达提示reBD-1有助于驯鹿的先天性宿主防御.     

湖羊和徐淮山羊CaSR基因组织表达水平的初步分析

为分析钙敏感受体(CaSR)基因对湖羊和徐淮山羊消化吸收的作用,以6个月龄的湖羊和徐淮山羊为试验材料,利用荧光定量PCR SYBR GreenⅡ荧光染料法,对湖羊和徐淮山羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠10个组织中CaSR基因的表达水平进行相对定量分析。结果表明:在湖羊的样品组织中,CaSR基因在十二指肠中表达量最高,其次是回肠,两者的表达量差异达到显著水平(P0.05);CaSR基因在瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、空肠、盲肠、结肠、直肠中的表达量显著低于在十二指肠及回肠中的表达量(P0.05)。在徐淮山羊的组织样中,CaSR基因在回肠中的表达量最高,其次是十二指肠,且二者差异显著(P0.05);另外,该基因在回肠和十二指肠的表达量显著高于在瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、空肠、直肠中的表达量(P0.05),盲肠和结肠中该基因的表达量最低。通过试验说明CaSR在不同组织里的表达具有特异性,在不同的物种间主要表达组织也不同,表明湖羊和徐淮山羊具有不同的消化吸收方式。     

绵羊防御素(sBD-1)cDNA的克隆及其植物中表达载体的构建

为了获得在植物中表达的绵羊防御素 ,从绵羊舌表皮组织中分离提取总RNA ,经逆转录PCR (RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1全长cDNA ,回收扩增产物连接到克隆载体 ,测序分析表明该cDNA为 2 1 5bp ,与报道序列完全一致。将该序列替换插入质粒PBI1 2 1中的GUS编码序列 ,构建植物表达载体PBIC 35SsBD1 ,为进一步进行转基因植物和绵羊防御素功能的研究奠定了基础。     

绵羊胃肠道游离氨基酸与小肽分布及其转运载体相关基因表达的研究

旨在研究绵羊胃肠道内游离氨基酸(FAA)和小肽(PAA)的数量分布和碱性氨基酸转运载体CAT1、酸性氨基酸转运载体EAAT3、中性氨基酸转运载体y+LAT2和ASCT2、小肽转运载体PepT1、氨基肽酶APN、二肽酶DPEP2mRNA在胃肠道的表达规律。试验选取18月龄健康小尾寒羊6只,屠宰后收集瘤胃、十二指肠、空肠、回肠和盲肠的食糜及对应肠道组织,对食糜上清液的小肽和游离氨基酸进行测定,并用实时定量PCR对基因表达量进行测定。结果显示:1)绵羊食糜多数游离氨基酸浓度从高到低的分布为空肠、十二指肠、回肠、瘤胃和盲肠,前二者显著高于其他部位(P0.05);不同部位游离氨基酸组成比例不同;多数小肽浓度从高到低的分布为十二指肠、空肠、回肠、盲肠和瘤胃,除瘤胃和盲肠外各部位间差异显著(P0.05);不同部位小肽的组成比例不同;小肽占总氨基酸(TAA)的比例在空肠显著低于其他部位(P0.05)。2)CAT1mRNA在空肠表达量最高,但不同部位间差异不显著;EAAT3、y+LAT2、PepT1、APN mRNA表达规律相似,均在回肠表达量最高;ASCT2mRNA在十二指肠表达量最高,DPEP2mRNA在盲肠表达量最高。结果提示,胃肠道不同区段游离氨基酸和小肽的浓度和组成不同;游离氨基酸的主要释放部位是空肠,主要吸收部位是回肠;小肽的主要释放部位是十二指肠,主要消化部位是空肠,在肠系膜系统的主要吸收部位是回肠;瘤胃和小肠各区段吸收碱性氨基酸的能力基本相同;酸性和多数中性氨基酸主要吸收部位是回肠,少数中性氨基酸主要吸收部位是空肠。本研究为绵羊小肠氨基酸营养和蛋白质消化吸收规律的研究提供了理论依据。     

Ghrelin及其受体和酰基化酶在羔羊不同组织的表达差异研究

采用real-time PCR检测生长激素释放肽(Ghrelin)及其受体(GHS-R)和酰基化转移酶(GOAT)在羔羊下丘脑、垂体、瘤胃、皱胃底、皱胃窦、十二指肠、空肠、回肠、心、肝、脾、肾、胰腺、睾丸的mRNA表达水平。结果显示,Ghrelin、GHS-R和GOAT mRNA在羔羊各组织中均有表达,其中Ghrelin mRNA主要表达于皱胃底(P0.01),其次是十二指肠和胰腺(P0.05);GHS-R mRNA主要表达于垂体(P0.01),其次是下丘脑(P0.05);GOAT mRNA在皱胃底和睾丸的表达水平相对较高,均显著高于其他组织(P0.05)。研究结果表明,Ghrelin系统在反刍动物组织中广泛分布,Ghrelin可能与GHS-R和GOAT共同参与协调羔羊生长调控、摄食等功能的调节作用,为进一步研究反刍动物体内Ghrelin的生物学功能奠定了基础。     

Ghrelin在马鹿器官组织中的表达

为研究Ghrelin在马鹿体内可能表达的器官,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法检测马鹿的舌、食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝、胰、颌下腺、腮腺、气管、肺、肾、输尿管、膀胱、卵巢、输卵管、子宫、阴道、大脑、下丘脑、垂体、松果体、甲状腺、肾上腺、心肌、心内膜、脾、淋巴结和骨骼肌中Ghrelin表达情况。结果显示,Ghrelin在皱胃内的表达量明显高于其他器官(P0.05);胰、子宫、卵巢、十二指肠和食管次之,与其余30种器官的表达量相比差异也显著(P0.05);其余器官内的表达量相对较少。结论:Ghrelin在所检测的36种器官内均有表达。     

梅花鹿体内脑肠肽的表达及细胞定位分析

为了明确脑肠肽Ghrelin(又名胃饥饿素)在梅花鹿体内的表达及定位,采用反转录-聚合酶链式反应(RTPCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学技术检测了梅花鹿食管、瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、肝、胰、甲状腺、垂体前叶、肺、肾、脾及卵巢等器官中Ghrelin mRNA的相对表达量和Ghrelin蛋白的定位分布情况。RT-qPCR结果显示:Ghrelin mRNA在上述器官中均有表达,其中皱胃内的表达量显著高于其他器官(P0.05);免疫组织化学染色结果表明Ghrelin蛋白在这些器官中均有表达,在消化管内的分布最为广泛。梅花鹿体内Ghrelin mRNA和Ghrelin蛋白的特定表达模式,揭示这一新型分子在梅花鹿的生长发育过程中可能存有广泛的生物学作用,尤其在胃肠道功能方面可能作为一种重要的调节方式而存在。     

钙离子跨膜吸收相关基因在内蒙古白绒山羊胃肠道中的差异表达

本试验旨在研究钙离子(Ca~(2+))跨膜吸收途径中的相关基因在内蒙古白绒山羊胃肠道中的表达差异分析。选用9只4月龄内蒙古白绒山羊断奶羔羊,屠宰后取瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠组织样品用于RNA提取,利用实时荧光定量PCR检测维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP-D9k)、瞬时性受体电位通道香草酸受体6(TRPV6)和维生素D受体(VDR)的mRNA表达量。结果表明:CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA均在十二指肠中表达量最高,CaBP-D9k和TRPV6 mRNA与VDR mRNA分别在大肠内、胃内处于较低的表达水平;CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA表达量随着小肠的延伸而逐渐降低。综合来看,CaBP-D9k、TRPV6和VDR mRNA表达量与胃肠道Ca~(2+)跨膜吸收能力存在关联性。     

湖羊消化道各段T1R1、T1R3及PepT1基因表达水平的分析

为分析T1R1(味觉受体1家族Ⅰ型)、T1R3(味觉受体1家族Ⅲ型)及PepT1(Ⅰ型寡肽转运载体)基因对湖羊氨基酸吸收的影响,以6月龄的湖羊为试验材料,采用荧光定量PCR技术对湖羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的T1R1、T1R3和PepT1基因的表达量进行相对定量分析。结果表明:T1R1和T1R3基因在检测的各段组织中均有表达,而PepT1基因在结肠中不表达;其中T1R1和T1R3基因在十二指肠中表达量最高,其次是空肠,并且两者差异显著极显著(P0.01);T1R1和T1R3基因在十二指肠(P0.01)和空肠(P0.05)中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著或显著;Pep T1基因在空肠中表达量最高,其次是回肠,并且两者差异极显著(P0.01);Pep T1基因在空肠和回肠中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著(P0.01)。该结果为进一步研究T1R1、T1R3和Pep T1基因对湖羊氨基酸吸收相关功能影响奠定基础。     

原位杂交技术检测蒙古绵羊胎儿β-防御素的表达

通过地高辛标记的原位杂交方法来检测β-防御素(sBD-2) mRNA在蒙古绵羊胎儿体内的表达。取4月龄的蒙古绵羊胎儿的肺、胃、肠、子宫、舌、心脏各1 cm3来做原位杂交。结果表明,sBD-2 mRNA在蒙古绵羊胎儿的肺、胃、肠、子宫、舌、心脏为代表的呼吸系统、消化系统、 吸收系统、生殖系统、肌组织中均有分布。因此,sBD-2作为一种广谱高效抗菌肽,广泛分布于胎儿体内。     

β防御素126在成年公山羊组织中的表达特性

为研究成年公山羊不同组织中β防御素126(gDB126)的表达特点,采集健康公山羊睾丸、附辜头、附睾体、附睾尾等生殖器官,以及心、肝、脾、肺、肾等组织器官,采用qRT-PCR探究gDB126mRNA的表达情况。结果显示:gDB126在公山羊生殖器官(输精管、附睾体、附睾尾)中大量表达,尤其在附睾尾1的表达量最高,而在泌尿器官(膀胱、肾上腺、肾脏)和消化器官(肠淋巴、回肠、甲状腺、空肠、十二指肠、食管、腮腺、皱胃)中微量表达另外gDB126在肺中也有较高表达。推测gDB126不仅与动物的抗菌作用相关,还可能与精子发生、运输、贮存、成熟有关。     

口蹄疫病毒受体整联蛋白在绵羊不同发育阶段组织中mRNA转录水平的分析

口蹄疫病毒野毒株利用整联蛋白（integrin）αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8作为受体侵入细胞。本研究采用实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）技术,定量检测绵羊胎儿（45、75和110 d的绵羊胎儿）、新生羔羊和成年绵羊组织中整联蛋白亚单位αv、β3、β6和β8转录水平。比较分析发现,在蹄冠上皮组织中,成年绵羊和新生羔羊的β6 mRNA水平低于75和110 d胎儿的;在心组织中,成年绵羊、新生羔羊和110 d胎儿的β6 mRNA高于45和75 d胎儿的;在肌肉组织中,胎儿和新生羔羊的β6以及β8 mRNA水平高于成年绵羊的;在舌上皮组织中,成年绵羊的β3 mRNA水平低于其他发育时期的。在软腭组织、扁桃体中整联蛋白mRNA水平在胎儿、新生儿和成年绵羊之间变化不大。本研究首次获得相关整联蛋白mRNA在绵羊不同发育阶段组织中分布的定量数据,为了解整联蛋白在口蹄疫病毒感染组织嗜性中的作用机制提供新的科学依据。     

术苦芩多糖对湿热泄泻仔猪小肠Notch信号通路干预的探究

为探讨复方术苦芩有效成分术苦芩多糖(ZKQPs)对湿热泄泻仔猪小肠Notch信号通路的干预,进一步阐明ZKQPs对湿热泄泻仔猪小肠修复作用机制。将60头断奶仔猪分为空白对照组(n=10)与造模组(n=50),并将造模成功后的50头仔猪随机分为模型组、阳性药物组、ZKQPs高、中、低剂量组,每组10头,拌料给药,连用7 d。每天观察各组仔猪临床症状,统计有效率、治愈率作为评价指标。用RT-PCR法检测湿热泄泻仔猪小肠组织中Notch-1、Hes-1和Hath-1的mRNA表达情况。模型组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Notch-1 mRNA表达量升高,ZKQPs各剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Notch-1 mRNA表达量降低,其中ZKQPs高剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Notch-1 mRNA表达量,与模型组比较,差异显著(P<0.05)。模型组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Hes-1 mRNA表达量升高,ZKQPs各剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Hes-1 mRNA表达量降低,除ZKQPs低剂量组仔猪十二指肠和空肠外,其余ZKQPs各剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Hes-1 mRNA表达量,与模型组比较,差异极显著(P<0.01)。模型组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Hath-1 mRNA表达量降低,ZKQPs各剂量组仔猪十二指肠、空肠、回肠中Hath-1 mRNA表达量升高,与模型组比较,差异极显著(P<0.01)。ZKQPs可通过降低仔猪小肠Notch信号通路中Notch-1、Hes-1的mRNA表达量和升高Hath-1 mRNA表达量来发挥修复肠道作用,达到治疗仔猪湿热泄泻。     

枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。     

蛋鸡小肠肽转运载体PepT1表达差异性的评定

本试验旨在研究蛋鸡十二指肠、空肠、回肠小肽转运载体mRNA表达的差异性.选用相同背景的健康成年蛋鸡10只,从十二指肠、空肠、回肠组织提取RNA样品,采用相对定量RT-PCR,对蛋鸡小肠各段肽转运载体mRNA表达的差异性进行评定.结果表明,蛋鸡空肠PepT1 mRNA的表达水平显著高于十二指肠(P＜0.05),与回肠比差异不显著(P＞0.05),十二指肠PepT1 mRNA的表达水平与回肠之间无显著差异(P＞0.05).     

维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素基因的表达调控

本试验旨在研究不同水平维生素D3对丝毛乌骨鸡组织中β-防御素(AVBDs)基因表达的调控.采用实时荧光定量PCR方法检测饲喂不同水平(800、1 600、3 200和6 400 IU/kg)维生素D3对丝毛乌骨鸡胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和法氏囊中3个β-防御素(AVBD-1、AVBD-5和GAL-1)基因表达水平的影响.结果表明:3个β-防御素基因在6个组织中均有表达,其中乌骨鸡AVBD-1和GAL-1基因的最高表达水平都在采食了3 200 IU/kg维生素D3时的空肠;AVBD-5基因的最高表达水平在采食了1 600 IU/kg维生素D3时的十二指肠;在依次采食维生素D3800、1 600、3 200和6 400 IU/kg的乌骨鸡组织中,3个β-防御素基因都存在先升后降的表达趋势.结果表明,β-防御素基因在同一组织的表达水平与维生素D3饲喂水平存在剂量关系,适宜的维生素D3饲喂水平能上调这3个β-防御素基因在乌骨鸡组织中的表达量.     

代乳粉添加枯草芽孢杆菌对7～28日龄湖羊羔羊胃肠道发育的影响

旨在观察代乳粉中添加枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)对7～28日龄湖羊羔羊胃肠道生长发育的影响。本研究选择健康、生长发育正常的7日龄湖羊公羔(双羔)30只,按同质性原则随机分为2组,每组15只,每只为1个重复,分别饲喂枯草芽孢杆菌含量为0和0.2%的代乳粉,试验期21 d。28日龄时每组随机选择8只羔羊进行屠宰,称量各胃室和各肠段内容物重量和净重量,量取各肠段长度,计算各段的相对重量和相对长度及内容物分布。采集皱胃胃底腺区及十二指肠、空肠和回肠中段的组织样品,用多聚甲醛固定后用于组织形态学测定,并测定小肠上皮细胞凋亡率。同时采集十二指肠、空肠和回肠黏膜,测定闭锁蛋白(occludin)、闭锁小带1(zonula occludens-1,ZO-1)和紧密连接蛋白1(claudin 1)mRNA表达量。结果表明:1)枯草芽孢杆菌显著降低7～28日龄湖羊羔羊十二指肠指数(占活体重量百分比,P=0.037)、空肠相对长度(占全肠长度百分比,P=0.009)和十二指肠绒毛宽度(P=0.001),显著升高羔羊结肠相对长度(占全肠长度百分比,P=0.012)、空肠内容物相对重量(占全肠内容物重量百分比,P=0.003)、回肠绒毛高度(P=0.010)和隐窝深度(P=0.034);2)枯草芽孢杆菌显著上调十二指肠黏膜ZO-1蛋白mRNA表达量(P=0.012),此外,枯草芽孢杆菌有上调羔羊回肠黏膜occludin蛋白mRNA表达量以及降低回肠上皮细胞凋亡率的趋势(P=0.053,P=0.079);3)枯草芽孢杆菌对其他胃肠段的相对重量(占活体重量、总胃重量、总肠重量和总胃肠重量百分比)及其内容物相对重量(占活体重量、总胃内容物重量、总肠内容物重量和总胃肠内容物重量百分比)、肠道相对长度(占全肠长度百分比)以及皱胃和小肠组织形态与小肠黏膜occludin蛋白、ZO-1蛋白和claudin 1蛋白mRNA表达量和小肠其他肠段上皮细胞凋亡率均未产生显著影响(P0.05)。枯草芽孢杆菌对7～28日龄湖羊羔羊胃肠道生长发育基本无显著影响,但可提高小肠屏障功能并减少上皮细胞凋亡,有利于保持小肠结构和功能完整。