猪轮状病毒中国分离株JL94 VP7基因的克隆与序列分析

用MA104细胞培养增殖了轮状病毒地方分离株JL94,利用一对根据Genebank中已发表的轮状病毒VP7基因cDNA序列而设计并合成的引物，通过反转录-聚合酶链反应(RT—PCR)从JL94毒株扩增出VP7基因全长cDNA。将其插人pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T—JL94／VP7，并对其进行了Hind Ⅲ，HindⅡ和BamH I的单、双酶切初步鉴定及其核苷酸序列测定，证明克隆的pMD18-T—JL94／VP7为轮状病毒的VP7基因。通过核苷酸序列比较，JL94／VP7与A群猪轮状病毒C134／VP7、OSU／VP7、ICB2185／VP7、YM／VP7核苷酸序列同源性分别为87％、99％、74％和83％。     

猪轮状病毒JL94株VP6基因克隆及同源性比较

通过反转录-聚合酶链反应(RT～PCR)扩增了猪轮状病毒国内地方分离株JL94的VP6基因cDNA片段。将其插入克隆载体质粒pMD18-T 的EcoRV酶切位点处，构建了重组质粒pMD18-T—VP6。对克隆的VP6基因进行序列测定，测序结果显示VP基因全长1356bp，并与猪A群轮状病毒OSU(亚组Ⅰ),Gottfried(亚组Ⅰ)的VP6进行同源性比较，结果显示，核苷酸序列同源性分别为86．85％、82．41％，氨基酸序列同源性分别为97．48％、93．20％，结果表明JL94分离株与OSU株在基因型上更为接近。     

猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6 cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni^2 金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26．5％,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。     

猪轮状病毒贵州株VP7基因克隆及生物信息学分析

为了解贵州省猪轮状病毒(PoRV)VP7蛋白的结构及功能,根据Gen Bank发表的猪轮状病毒VP7基因序列设计1对特异性引物,扩增1株猪轮状病毒贵州流行株VP7基因全序列并进行序列测定及生物信息学分析。结果显示:VP7基因全长为1 062 bp,包含一个981 bp的开放发阅读框,编码326个氨基酸,氨基酸突变主要发生在高变区。与已知的14个国内外参考毒株VP7核苷酸和推导的氨基酸序列比较,同源性分别为71.5%~97.0%和72.4%~98.7%,与G4型毒株核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为86.6%~97.0%和92.9%~98.7%。核苷酸系统进化树结果显示,贵州流行株与G4型毒株CMP070/09属同一个分支,因此推测贵州流行株为G4型猪轮状病毒。预测PoRV VP7蛋白理论相对分子质量为37.2 ku,等电点为4.75,半衰期为30 h,不稳定系数为31.22;跨膜结构及信号肽分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,无信号肽区域;抗原表位预测显示VP7蛋白在第69~104、145~150、176~183、210~224、311~321位及其附近肽段可能为其优势抗原表位;结构预测显示,VP7蛋白存在1个N-糖基化作用位点、14个磷酸化位点,不存在O-糖基化位点。     

猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析.结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型.本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础.     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

猪轮状病毒L1株VP7基因克隆及序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP7基因保守序列,设计特异性引物扩增猪轮状病毒L1株VP 7全基因序列并进行序列测定及分析。结果显示, L1株猪轮状病毒VP 7基因全长为1062 bp,包含一个982 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与G5型参考毒株核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为88．8％～93．7％和93．3％～94．2％,系统进化树分析结果亦显示L1株与G5型参考毒株处于同一个群,由此确定L1株为G5型。与我国近几年流行的G9型毒株NMTL进行抗原表位分析结果显示,两个毒株在 aa25～aa29、aa86～aa102、aa142～aa152、aa211～aa226、aa263～aa286等区域存在明显差异,可能对其免疫保护性存在一定的影响。     

猪轮状病毒GD1株VP7基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP7基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD1株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP7基因全长1 062 bp,含有一个981 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸。与国内外已知的13个毒株VP7全长基因的核苷酸及推导的氨基酸序列比较,相似性分别为77.4%～100%和78.6%～99.7%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD1毒株与轮状病毒A2,JP3-6毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。     

轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析

用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从轮状病毒感染的细胞中扩增816bp,916bp的VP4，VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM-T上，转化至受体菌DH5α中，提取质粒经PCR扩增，酶切鉴定，证明重组质粒pT-V4,PT-V7中含有轮状病毒的VP4，VP7基因片段。经核苷酸序列分析。表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4，VP7基因中抗原表位区。     

猪A组轮状病毒VP7基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪A组轮状病毒VP7基因功能,根据GenBank中猪轮状病毒VP7基因DNA序列设计引物,以实验室轮状病毒上海分离株SH-1为模板,进行PCR扩增,将VP7基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码326个氨基酸,其相对分子量为37.38 Ku,理论等电点(PI)为4.77。VP7蛋白以α螺旋为主,主要有13个抗原表位区域。系统进化树分析显示分离株SH-1与KM230930.1株亲缘关系最近,基因型分析结果是G10型,属于人兽共患病毒株。     

Cloning and Eukaryotic Expression Plasmid Construction of Porcine Interleukin-18 Gene

To obtain recombinant eukaryotic expression plasmid of porcine interleukin-18(IL-18), the whole gene of porcine IL-18 gene was amplified from porcine spleen, lung and lymph nodes by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pZJ-1. The recombinant expression plasmid pZJ-IL-18 were identified by enzyme digestion and sequencing analysis, and was transfected into 293T cells.The expression of IL-18 was detected by Real-time PCR and Western blotting in both gene and protein levels. The results showed that the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 was constructed and could express transiently in 293T cells. Western blotting result confirmed that porcine IL-18 polyclonal antibody could react specifically with approximately 17 ku expression products,and indicated that IL-18 could express correctly and be responsive.This study constructed the eukaryotic expression plasmid of porcine IL-18 gene which could express transiently in 293T cells, and laid the foundation for studying function of IL-18.     

猪白细胞介素18基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

为获得表达猪白细胞介素18（interleukin-18,IL-18）的真核表达重组质粒,试验通过RT-PCR从猪脾脏、肺脏和淋巴结组织中扩增猪IL-18全基因并定向克隆到真核表达载体pZJ-1,测序分析和酶切鉴定正确后,转染至293T细胞中,并通过实时荧光定量PCR和Western blotting分别在基因和蛋白水平检测IL-18的表达。结果表明,试验成功构建了真核表达重组质粒pZJ-IL-18,且可以在293T细胞中表达IL-18基因。Western blotting试验证实,猪IL-18多克隆抗体能与约17 ku的表达产物发生特异性反应,表明IL-18能正确表达且具有反应原性。本试验构建了表达猪IL-18基因的真核表达质粒,并在293T细胞中瞬时表达,为进一步研究IL-18的功能奠定基础。     

猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价

【目的】构建猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列（登录号：MH898990.1）合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过Pme Ⅰ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）;通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2 343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于10^5.3 TCID₅₀ TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平（P<0.05）;10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于10^5.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）,而10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于10^6.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）。10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著（P>0.05）。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀。10^6.5和10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析

根据PPVNADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1VP2蛋白在77~82、291~304、362~373、400~411、465~477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60~68、81~88、266~275、351~357、398~404位点处。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...