基因修饰的鸡新城疫病毒HN基因DNA疫苗免疫效力评价

为了评价基因修饰对提高DNA疫苗免疫效果的影响,将NDV F48E9株HN基因进行密码子优化和信号肽替换,修饰后的基因命名为SoptiHN,将HN和SoptiHN基因分别克隆至pVAX 1和含CpG-ODN刺激序列的载体pVAX 1-CpG中,共获得pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-HN和pVC-HN 4种质粒.将4种质粒股四头肌多点注射3周龄SPF鸡,每只鸡200 μg,以PBS为非免疫对照;一免后3周以相同的剂量加强免疫,二免后2周以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒,计算发病率、死亡率以及排毒情况.试验期间每周采集血清进行HI抗体的检测,同时采集抗凝血分离外周血淋巴细胞,分析免疫后各试验组IFN-y和IL-18的变化情况.结果表明,疫苗免疫1周后,所有免疫组均能产生抗NDV的HI抗体,pV-SoptiHN和pVC-SoptiHN组最高,与其他组差异显著;pVC-SoptiHN和pVC-HN质粒免疫组IFN-γ和IL-18表达水平要略高于pV-SoptiHN和pV-HN质粒免疫组.攻毒结果显示,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的死亡保护率均为71%,排毒检出率均为25%,而pV-HN和pVc-HN免疫组的保护率均为50%,排毒检出率分别为50%和44%,pVAX1、pVAX1-CpG和PBS对照组攻毒后的死亡率均为100%,排毒检出率均为100%,pV-SoptiHN与pVC-SoptiHN免疫组的排毒时间与其他5组相比有所缩短.以上结果表明,修饰后的HN基因可以诱导鸡产生更强烈的免疫反应,获得更好的保护效率.     

单表达和共表达NDVF和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验

为评价母源抗体对抗新城疫病毒(NDV)重组鸡痘病毒(rFPV)活疫苗免疫效力的影响,本研究用单表达、共表达NDV基因VII型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12LSF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳剂灭活疫苗分别免疫14日龄商品蛋鸡,rFPV疫苗的免疫剂量均为2×104pfu,免疫后21d分别用106ELD50NDV不同强毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保护率分别为30.3%、73.2%、41.1%;而ZJ1株攻毒的免疫保护率分别为89.3%和35.8%、67.9%、78.6%、100%。用表达鸡IL-2基因的rFPV-12LSIL-2与rFPV-12LSHN联合免疫没有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保护力。试验结果表明,单表达NDV HN基因的rFPV-12LSHN可作为NDV活疫苗候选株,为NDV重组鸡痘病毒活疫苗的进一步应用性开发奠定了基础。     

携带新城疫病毒F基因DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)基因序列,设计1对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源NDV分离株JS5F基因(约1700bp),测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,获得重组真核表达质粒pVAX1-F。pVAX1-F经脂质体转染COS-7细胞,间接免疫荧光试验检测出F基因在COS-7细胞中的表达产物。将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F)。重组菌以109CFU/只的剂量2次免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体和小肠粘膜抗体应答,SL7207(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于SL7207(pVAX1)组(P<0.05)。将SL7207(pVAX1-F)以109CFU/只剂量口服免疫1日龄雏鸡,免疫保护试验结果显示,SL7207(pVAX1-F)免疫组对鸡具有良好的保护率(77.27%),与空白对照组和SL7207(pVAX1)空载体组之间存在显著性差异(P<0.05)。结果表明,该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能成功释放所携带的质粒,并能刺激机体产生免疫应答,可对NDV强毒攻击提供良好的免疫保护作用,提示该疫苗候选株对新城疫的控制有重要应用前景。     

Immune protection assay of Newcastle disease live vaccine （LaSota Strain） against a genotype VII NDV isolate

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒（NDV）,命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因VII型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSota后14d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLY01攻毒组第5d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSota活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100％免疫保护,但不能完全抑制基因VIINDV分离株在体内的复制和排毒。     

新城疫LaSota活疫苗对基因Ⅶ型分离株的免疫保护性试验

从山东省发病鸡群分离鉴定了一株新城疫病毒(NDV),命名为SDLY01。经蚀斑纯化后进行毒力测定和序列分析表明分离株SDLY01属于基因Ⅶ型NDV强毒。20只7日龄SPF鸡免疫新城疫活疫苗LaSot a后14 d分别用NDV标准强毒F48E8和分离株SDLY01攻毒,同时设同日龄SPF鸡为对照组,未免疫任何疫苗。攻毒后观察10 d,免疫组在攻毒后食欲、精神均正常;对照组在攻毒后2～4d发病死亡,并表现ND典型的临床症状和病理变化。攻毒后第3、5、7、9 d对免疫组试验鸡取喉头、泄殖腔棉拭进行病毒分离,F48E8攻毒组病毒分离均为NDV阴性,SDLYO1攻毒组第5 d病毒分离NDV阳性,第3、7和9d病毒分离阴性。本研究结果表明LaSot a活疫苗对F48E8和SDLY01均能提供100%免疫保护,但不能完全抑制基因Ⅶ NDV分离株在体内的复制和排毒。     

CpG基序对新城疫病毒DNA免疫效果的影响

为评价CpG基序对新城疫病毒(NDV)DNA免疫效果的影响,本研究将NDVF48E9株的F基因分别克隆至真核表达载体pVAX1和含有3个CpG基序的载体pVAX1-CpG中,分别命名为pV-F和pVC-F,体外表达检测结果显示,pV-F和pVC-F外源基因表达量无明显差别。将pVAX1、pVAX1-CpG、pV-F和pVC-F经腿部肌肉多点注射3周龄SPF鸡(200μg/只),2周后以相同的剂量加强免疫,二免后2周通过滴鼻以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒。抗体检测结果表明,免疫组的抗体水平与对照组相比差异显著(p0.01),pVC-F免疫组的抗体水平高于pV-F免疫组;淋巴细胞检测结果表明,pV-F和pVC-F免疫组与对照组显著差异(p0.01);攻毒保护率结果显示,pVC-F和pV-F组的保护率分别为60%和50%,对照组为0。以上结果表明,CpG基序对机体细胞免疫反应有一定的增强作用。     

鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究

本研究旨在评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平（P〈0.01）,对NDV强毒攻击的保护率仍然为100%。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。     

纹身法免疫增强DNA疫苗免疫效果的评价

为评价不同DNA免疫方法(皮内穿刺、肌肉注射)对DNA疫苗免疫效果的影响,将自行构建的表达传染性喉气管炎病毒gJ基因的真核表达载体pCDNA3.1-gJ和表达新城疫病毒F基因的真核表达载体pVAX1-F通过普通注射器裸DNA肌肉注射和纹身器皮下裸DNA纹身法投递,分别免疫BALB/c小鼠和SPF鸡,三免后2周用NDV强毒株进行攻毒.采集免疫后小鼠和鸡的血清,ELISA法检测抗体水平,并计算鸡攻毒后保护率,来评价这2种免疫途径的免疫效果.结果表明,纹身法皮下投递诱导的特异性免疫应答抗体水平显著高于DNA肌肉注射的抗体水平,而且通过纹身法投递质粒二免后产生的抗体水平显著高于肌肉注射三免后的抗体水平.此外,通过纹身法投递50μg质粒产生的抗体水平高于同一时期通过肌肉注射100 μg质粒产生的抗体水平}攻毒试验表明,和肌肉注射免疫相比,纹身法皮肤免疫的免疫保护效果更佳.以上结果表明,纹身法皮下投递DNA疫苗,能诱导产生更强大的免疫应答,而且还是一种经济实用的方法,它将满足实验室条件下产生更快更强大免疫应答的需要,也为今后DNA疫苗免疫方法和途径研究提供新的思路.     

鸡传染性法氏囊病病毒超强株VP2基因重组新城疫病毒胚胎免疫安全性及效力试验

为研制能够同时预防传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)的疫苗,本研究选用表达IBD病毒(IBDV)超强毒株(vvIBDV)VP2基因的重组ND病毒(NDV)LaSota疫苗株(rL-VP2),测定其半数鸡胚感染量、平均鸡胚致死时间、脑内接种指数和静脉内致病指数等指标,按不同剂量接种18胚龄SPF鸡胚,分别于出雏后第9d、第14d和第21d采血,用微量凝集法和ELISA方法测定血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平,并于出雏后28d用NDV强毒(F48E9株)和vvIBDVGx株攻毒,评估重组疫苗的胚胎免疫效果。结果显示:按104EID50/枚剂量进行免疫不会影响SPF鸡胚出雏率和出雏后21d存活率,并且该免疫组雏鸡能够对NDV强毒和vvIBDV攻毒提供安全的免疫保护。     

DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验

应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒（NDV）国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验。结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%。本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持。     

新城疫病毒F基因的真核表达及其免疫原性检测

为了探讨F基因在DNA免疫防制新城疫(ND)中的免疫原性,将NDV Z株F基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-H is-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNA NDV ZF。在脂质体作用下将pcDNA NDV ZF转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中可见有大量F蛋白表达。将重组质粒以100μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,经间接ELISA试验检测二免前后的血清,结果证明,pcDNA NDV ZF基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生,具有特定的免疫原性。     

新城疫La Sota疫苗对山东分离株的免疫保护试验

用标准疫苗株La Sota活疫苗在隔离器中接种SPF鸡,进行免疫保护试验.免疫后,每7 d采血监测NDV抗体,免疫后2周,利用经过鉴定的新城疫病毒(NDV)潍坊毒SGM01、昌乐毒SCL03、东营毒HY、日照毒SRZ03、莘县毒SSX03和标准强度F48E9分别进行攻毒试验,同时设SPF鸡对照.每天观察,及时剖检发病鸡,检查鸡群病变,确定疫苗的保护性.结果表明,La Sota疫苗能对除SGM01和HY以外的病毒攻击的SPF鸡提供较好的保护.     

基于新城疫病毒V蛋白鉴别鸡群感染与免疫的间接ELISA方法的建立

本研究以新城疫病毒(NDV)V蛋白羧基端结构域(Vc)的重组蛋白为包被抗原,建立了用于检测NDV V蛋白抗体的间接ELISA方法,并采用该方法检测了鸡群免疫或接毒后血清中的V蛋白抗体水平。结果显示:两组不同NDV灭活疫苗组在免疫后的3周内检测结果均为阴性;两组灭活疫苗免疫3周后再人工感染NDV强毒的鸡群,攻毒后第7、14和21 d,NDV阳性率分别为60%、80%、70%和50%、80%、70%;两组不同的NDV弱毒疫苗免疫组鸡群,仅在免疫后第21 d阳性率分别为20%和10%。以上结果表明,NDV疫苗免疫组与强毒感染组的V蛋白抗体阳性率存在明显差异,本方法可在群体水平上区分新城疫疫苗免疫与强毒感染鸡群,为NDV血清学诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。     

含粘膜佐剂的鸡新城疫疫苗诱导雏鸡非特异性免疫应答的研究

为研究分析重组大肠杆菌不耐热肠毒素（labile enterotoxin,LT）作为粘膜佐剂,配伍鸡新城疫疫苗的冻干样品对免疫鸡非特异性免疫应答的影响,在前期已经构建的LTR72/G192基础上,选择2、4μg LTRG蛋白作为每羽份疫苗添加量,及降低新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）50%抗原量等配伍条件。按照生产条件制备冻干疫苗,进行雏鸡免疫试验,免疫后24、48、72 h采集脾脏、胸腺淋巴结,检测几种非特异性细胞因子表达水平。结果表明：IL-6、INF-γ水平在各疫苗免疫后24h即升高,48 h达最高值;添加2、4μg LTRG蛋白的NDV疫苗组IFN-β、TNF-α水平在48 h左右显著升高,其中含4μg LTRG疫苗组与其他组差异具有极显著统计学意义（P〈0.01）;IL-6、IFN-γ转录水平有所增强,但各组间差异不具有显著统计学意义（P〉0.05）,72 h左右几种细胞因子水平均迅速下降,与NDV疫苗接种组相近。由此可见,LTRG能辅助抗原诱导免疫雏鸡的非特异性免疫应答,有利于对感染病毒的清除。     

Advancement in vaccination against Newcastle disease: recombinant HVT NDV provides high clinical protection and reduces challenge virus shedding with the absence of vaccine reactions

Newcastle disease (ND) is a highly contagious disease of chickens causing significant economic losses worldwide. Due to the limitation in their efficacy, current vaccination strategies against ND need improvements. This study aimed to evaluate a new-generation ND vaccine for its efficacy in providing clinical protection and reducing virus shedding after challenge. Broiler chickens were vaccinated in ovo or subcutaneously at hatch with a turkey herpesvirus-based recombinant vaccine (rHVT) expressing a key protective antigen (F glycoprotein) of Newcastle disease virus (NDV). Groups of birds were challenged at 20, 27, and 40 days of age with a genotype V viscerotropic velogenic NDV strain. Protection was 57% and 81%, 100% and 95%, and 100% and 100% after the subsequent challenges in the in ovo and subcutaneously vaccinated chickens, respectively. Humoral immune response to vaccination could be detected from 3-4 wk of age. Challenge virus shedding was lower and gradually decreased over time in the vaccinated birds compared to the unvaccinated control chickens. In spite of the phylogenetic distance between the NDV F gene inserted into the vector vaccine and the challenge virus (genotype I and V, respectively), the rHVT NDV vaccine provided good clinical protection and significantly reduced challenge virus shedding.     

从自然发病鸡中分离出一株新城疫病毒

应用电镜技术、血清学检查、生物学试验等方法,从未注射过疫苗的某自然发病鸡群分离出一株新城疫病毒。该分离株对１０日龄鸡胚的平均致死时间为１１６小时,静脉接种致病指数为０．０６,其毒力介于新城疫病毒的ＬａＳｏｔａ株与Ｖ４株之间。免疫原性试验结果表明,该分离株具有免疫后无不良反应、免疫后６天开始产生抗体、产生的抗体效价高、对新城疫强毒的攻击能１００％保护等特点,是一株良好的新城疫候选疫苗株     

减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗诱导对新城疫病毒的免疫保护

探讨了以减毒鼠伤寒沙门氏茵为栽体传递新城疫病毒DNA疫苗的安全性、免疫原性和可行性。将含新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pcDNA3-F的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株(ZJ111／pcD-NA3一F菌株)，以10^8CFU进行首免，2周后二免，三免后4周攻击强毒株F48E9，观察其安全性和免疫原性，同时设只含空载体pcDNA3的ZJ111／pcDNA3菌株对照及口服PBS对照。结果表明：重组ZJ111／pcDNA3-F菌株具有良好的安全性。对强毒株攻击的保护率达64．7％。重组ZJ111／pcDNA3-F菌株不仅能诱导雏鸡产生NDVELISA抗体，而且诱导产生的法氏囊B淋巴细胞和胸腺T淋巴细胞增殖反应显著高于ZJ111／pcDNA3时照组。这些结果提示，减毒沙门氏菌为载体不仅可直接将NDVF基因呈递给鸡体细胞进行表达，产生抗NDV的体液免疫，而且还可诱导细胞免疫应答。     

鸽禽Ⅰ型副粘病毒油佐剂灭活苗对雏鸡免疫效果评价

用鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗与ＮＤＶ油佐剂灭活苗分别免疫雏鸡,免疫后２１ｄ抗体水平达到峰值,免疫后４２ｄ用新城疫强毒对两种疫苗免疫鸡分别进行攻击,鸽Ａ／ＰＭＶ－１油佐剂灭活苗免疫组保护率为７３．３３％,ＮＤＶ油佐剂灭活苗免疫组保护率为９９．６７％。