斯里兰卡木薯花叶病毒 TVM3 分离物侵染性克隆构建及鉴定

【目的】斯里兰卡木薯花叶病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus, SLCMV）是一种对世界木薯产业产生威胁的单链环状 DNA 病毒,为双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色黄花叶病毒属（Begomovirus）成员。我国木薯品种抗性不明且抗病种质资源缺乏,为进一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景以及 SLCMV 与宿主的互作机理,本研究开展 SLCMV 侵染性克隆构建及鉴定。【方法】以 SLCMV（TVM3 株系）为对象,将其1.10 倍（mer）长的 DNA-A 和 1.08 倍（mer）的 DNA-B 组分分别构建到 pCAMBIA1301 载体,获得病毒侵染性克隆载体 pCAMBIA1301-DNA-A （pDNA-A）和 pCAMBIA1301-DNA-B （pDNA-B）,利用 GV3101 农杆菌介导pDNA-A 和 pDNA-B 共侵染本生烟和拟南芥。【结果】SLCMV 侵染性克隆接种本生烟 14 d 后,系统叶可产生严重的花叶、扭曲等症状;而感染 SLCMV 的拟南芥叶片在 18 d 出现轻微的扭曲症状。提取感病本生烟和拟南芥植株新生叶片总 DNA,PCR 方法均检测到了病毒 DNA-A 和 DNA-B 组分。此外,本生烟的病毒感染率为 100%,而拟南芥的病毒感染率仅为 40%,两者差异显著（P<0.05）。【结论】本研究成功构建了 SLCMV 病毒侵染性克隆,且能侵染本生烟和拟南芥植物,其在本生烟中的病毒感染率高达 96.67%;另外,该 pDNA-A 和 pDNA-B 侵染性克隆载体序列仅为病毒原基因组 DNA-A 和 DNA-B 大小的 1.10 倍（mer）和 1.08 倍（mer）,且不含有重复的编码区序列,可为下一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景以及病毒致病机理研究提供重要基础。     

柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14...     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT－PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV－PE）全长RNA3。经核苷酸序列测定，明确PE分离物RNA3全长2216nt，含有2个开放阅读框（ORDF），其中5'端的ORF（121－963nt)编码279aa的3a蛋白，3'端ORF（1260－1916nt)编码218aa的CP蛋白。5'端非编码区（NR）长120nt，基因间隔区（IP）长296nt，3'端NR区含301个碱.PE分离物编码的3a蛋白最明显的特征是在136－141位有一个独特的VWCLSS区域，将CMV－PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码 区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关。     

侵染大丽花的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质，初步鉴定在厦门地区种植的大丽花上表现花叶症状的病株上分离的1个病毒分离物属于黄瓜花叶病毒。在供试的11科39种(或品种)植物中，该分离物通过摩擦接种能侵染其中的9科35种(或品种)；失活温度为50-55℃，稀释终点为10^-3～10^-4，体外存活期为24-28h；病毒粒体球状，直径约28-30nm。经间接ELISA测定，该分离物与烟草花叶病毒、南瓜花叶病毒、烟草环斑病毒、番茄不孕病毒、西番莲木质病毒的抗血清均无反应。与黄瓜花叶病毒抗血清具有强阳性反应，鉴定该病毒是黄瓜花叶病毒。     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒分离物的亚组鉴定及株系分析

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成 1 对引物,对侵染辣椒的黄瓜花叶病毒湖北分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析.结果表明:湖北省内不同辣椒主产区采集到的样品CP基因之间的核苷酸同源率高达98.2%～99.2%,与CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ各株系之间的核苷酸同源率分别为92.1%～96.5%和72.1%～78.1%,并且和亚组Ⅰ中的ⅠB系列株系同源率更高.由此确认这4个CMV分离物属于亚组Ⅰ中的ⅠB成员.     

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

【目的】构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer^?RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C. paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C. paradisi×Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P. trifoliata×C. sinensis)、枣阳小叶枳(P. trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建...     

黄瓜花叶病毒贵州辣椒分离物外壳蛋白基因序列分析

[目的]分析贵州辣椒主产区黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物的分子变异情况,为抗病毒辣椒品种选育及辣椒病毒病的防控提供科学依据.[方法]以来自贵州省8个县(榕江、大方、石阡、安龙、绥阳、德江、关岭和惠水)的16个辣椒CMV分离物为材料,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增辣椒CMV分离物的CP基因序列,利用DNAMAN和BioEdit对CMV分离物的CP基因序列进行比对分析,用MAGE 7.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树,分析贵州辣椒CMV分离物的遗传多样性.[结果]将16个贵州辣椒CMV分离物的CP基因核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列与CMV亚组代表株系进行一致性比对,结果表明,贵州辣椒CMV分离物与CMV亚组分离物的CP基因核苷酸序列一致性为89.7%~100.0%、CP蛋白氨基酸序列一致性为96.8%~100.0%.系统进化分析结果表明,CMV-DF、CMV-RJ、CMV-SQ、CMV-SY、CMV-DJ与CMV I代表株系聚为一个亚支,但更趋近于CMV亚组IB株系,CMV-HS、CMV-GL、CMV-AL与CMV亚组Ⅱ株系聚为另一个亚支,说明侵染贵州辣椒的CMV株系有两大组群,其中大方、榕江、绥阳、石阡和德江CMV分离物归属于CMV亚组IB株系,惠水、关岭和安龙CMV分离物归属于CMV亚组Ⅱ株系.[结论]不同地域的贵州辣椒CMV株系发生了变异.     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列(GenBank登录号:KX883801)设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F:CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R:TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F:AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R:AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为...     

侵染蚕豆的黄瓜花叶病毒的分离和鉴定

根据鉴别寄主反应、寄主范围测定、介体传播特性、粒体形态以及血清学诸项试验,将蚕豆病毒分离物B_5鉴定为黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus,CMV)。B_5液接种能侵染7科20余种植物。在蚕豆的接种叶上形成红褐色坏死斑,有或无系统侵染;局部侵染苋色藜和昆诺藜;系统侵染心叶烟和番茄分别引起花叶和蕨叶症。B_5可经桃蚜、棉蚜和甘篮蚜的非持久方式传播。B_3在电镜下粒体形态为球状,直径28～30nm。B_5病株的粗制液在免疫双扩散试验中能和黄瓜花叶病毒的抗血清起反应,且在免疫电镜试验中,黄瓜花叶病毒抗血清处理的铜网能捕获大量B_5粒体。     

基于基因组序列分析的烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物侵染性克隆构建

【目的】烟草花叶病毒属（Tobamovirus）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一,严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性,为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样,提取总RNA,利用TMGMV特异检测引物确认阳性后,设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列,通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上,获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性,利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒,经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果,测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt,编码4个功能蛋白,分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白C...     

黄瓜花叶病毒辣椒分离株抗性遗传规律的研究

采用4×4完全双列杂交方法研究了辣椒对黄瓜花叶病毒辣椒分离株(CMV-P)抗性的遗传规律,研究结果表 明,辣椒对CMV-P的抗性至少受4对以上核基因控制,具有数量性状遗传特点;抗性的回交效应显著而正反交效应不显著;辣椒对CMV-P的抗性遗传经检验符合“加性——显性”模型,主要受基因的加性效应影响。群体中抗病基因频率高于感病基因频率。通过自交、回交、系统选择可获得抗病性超亲的系统。抗×感组合的F1代很难获得超亲组合,要获得高抗杂交组合需选双亲都高抗的亲本。     

马铃薯纺锤块茎类病毒山西分离物侵染性克隆的构建

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viriod,PSTVd)侵染马铃薯会严重影响薯块的产量和品质。根据PSTVd的同源序列设计引物,以山西省马铃薯感病块茎中提取的总RNA为模板,经RT-PCR方法扩增出全长cDNA片段,将其克隆到质粒pBS-T载体上,进行序列分析。结果表明,该类病毒全长359 nt,能通过分子内序列互补形成致密的二级结构。以该序列作为种子序列进行Blast搜索,该序列与PSTVd荷兰分离物(GenBank登陆号:AY372400.1)的序列一致性为100%。将该序列与东北株系、河北株系及已公布的弱株系(GenBank登陆号:M14814.1)、强株系(GenBank登陆号:U23058.1)、中间株系(GenBank登陆号:AY937179.1)比对,有12个核苷酸具有多态性,其中有5个发生在致病区。将线性化的质粒pBS-PSTVd及其PSTVd的体外转录产物接种番茄矮红宝的无毒苗,20 d后接种株轻微显症,RT-PCR检测均呈阳性。将RT-PCR产物测序,其结果与接种的PSTVd原序列完全一致,证实构建的PSTVd山西分离物的克隆具有侵染性。     

辣椒抗黄瓜花叶病毒病研究进展

黄瓜花叶病毒病(CMV)是危害辣椒的主要病害之一,严重影响辣椒的品质和产量。本文介绍了黄瓜花叶病毒对辣椒的危害与防治,综述了其抗病种质材料的筛选、抗性遗传规律分析、QTL定位及基因发掘等,并对存在的相关问题进行展望与分析,以期为辣椒抗CMV研究和分子标记辅助育种(MAS)提供一定的理论参考。     

Study on Graft-induced Resistance to Cucumber Mosaic Virus in Pepper

To introduce CMV resistance to susceptible variety, interspecific grafting between d45-6 (Capsicum annuum) and LS1205 (C. baccatum) was conducted. The graft-progenies, G1 and G1S1 were obtained. Mechanical inoculation with CMV showed that disease index of G1and G1S1 were significantly decreased, similar to that of the resistant stock. EUSA serological test indicated that resistance of LS1205 and the graft-progenies to CMV was caused by inhibition of virul replication. Further, peroxidase isozymatic analysis revealed that zymotypes of G1 were a summation of those found in the donor plants. This result perfectly fit the theory of gene transformation and reconfirmed the conclusion of mechanism of graft-induced variants.     

引起辣椒黄白花叶、内卷的一个病毒分离物的鉴定

从新疆石河子地区辣椒病毒病株上分离到一株病毒 PV分离物。测定表明能侵染 6科 34种植物 ,引起辣椒局部褪绿斑和圆环 ,系统白色至黄色花叶 ,内卷和矮化。桃蚜不能传毒 ;钝化温度 65～ 70℃ ,稀释限点 10 -4～ 10 -5 ,体外保毒期 3个月以上 ;病毒颗粒杆状 ,大小 2 5 8nm×16 nm;外壳蛋白分子量 18.0 KD;琼脂双扩散和交互保护反应测定 PV与烟草花叶病毒(TMV)相关密切 ;电镜下观察到辣椒病组织中含有病毒粒子的集结体、假晶体、叶绿体内的网膜状结构和分散病毒粒子。初步认为该分离物是 TMV,但寄主反应、粒体大小、致死温度和异常内含体与文献报道的 TMV各分离物有所不同 ,可能是 TMV普通株系的变异体。     

侵染丝瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒山东分离物分子鉴定

2013年,在山东泰安采集到疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的丝瓜样品,利用该病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)特异引物CG-CPF/CPR对样品进行扩增并测序。所得序列(GenBank登录号:KJ187042)经NCBI BLAST比对,与已登录的CGMMV序列的相似性均大于92.6%,确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。系统进化分析表明,CGMMV山东丝瓜分离物(CGMMV-SDLoofah)与辽宁分离物(CGMMV-LN)等大多数国内CGMMV分离物同聚为一个进化组,从而进一步确定了CGMMV山东丝瓜病毒分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒。这是首次报道黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染丝瓜。     

Construction Strategy and Affecting Factors of Positive-Strand RNA Virus Infectious Clone

Construction of infectious clones by full-length cDNA is basic and key for recovering RNA virus and is core of reverse genetics.In this article,basic consideration and key technology were viewed and factors affecting infectivity of clones were also summarized.Some research advances were briefly introduced about positive-strand RNA viruses infectious clones.Finally,this article also reviewed the application of infectious clones.