马乙型脑炎病毒NS1基因的原核表达及抗原性鉴定

为了研究马乙型脑炎病毒NS1蛋白的特性,试验采用RT-PCR方法获得SA14-14-2弱毒株的NS1基因,将该基因克隆于pMD18-T载体后进行测序,进而构建重组表达质粒pET28a-NS1,并转化于Rosetta(DE3)中,再进行IPTG诱导和SDS-PAGE分析。结果表明:获得分子质量约为46 ku的重组蛋白,经Western-blot和间接ELISA检测证明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。     

稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立

为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础.     

流行性乙型脑炎病毒NS1基因克隆及其蛋白表达纯化

为了表达流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis type B）非结构蛋白NS1,本研究通过PCR扩增了日本乙脑病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）P3株NS1基因,并分别构建了其融合表达His和GST标签的原核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达了NS1融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行鉴定,并用尿素变性复性和镍亲合层析法纯化目的蛋白。结果显示,试验成功构建了NS1的两个原核表达载体pET-42b-NS1和pGEX-KG-NS1,P3株NS1基因全长1 056 bp,以包涵体的形式表达约40 ku的蛋白,尿素变性复性效果较好,镍亲合层析纯化得到纯度和浓度均较高的NS1蛋白。JEV NS1基因可以通过原核表达系统高效表达蛋白并纯化得到高纯度产物,为后期生物学功能研究奠定基础。     

乙型脑炎病毒NS1’蛋白移码序列的鉴定

本文通过对猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中移码序列分析,设计合成三条引物,通过PCR扩增出假定的NS1’移码片段,并将移码片段三倍重复克隆入pET-28a表达载体中。重组质粒转化E.coli BL-21后,经IPTG诱导在37℃下实现目的片段的可溶性表达。纯化表达产物,并免疫小鼠制备了多抗血清,以多抗血清为一抗,对JEV感染的Vero细胞进行免疫荧光分析,结果发现抗移码片段表达蛋白的血清可识别JEV蛋白。以JEV感染Vero细胞,提取感染细胞总蛋白,分别以NS1单抗和以上制备的多抗血清为一抗,进行Western blot分析。结果显示,NS1单抗为一抗,可染出48 kDa的NS1条带和56 kDa的NS1’条带;而以多抗血清为一抗,仅染出56 kDa的条带。上述结果显示,多抗血清识别的NS1’蛋白为NS1’移码后片段表达的蛋白。     

乙型脑炎病毒NS1′蛋白移码序列的鉴定

本文通过对猪乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）基因组中移码序列分析,设计合成三条引物,通过PCR扩增出假定的NS1′移码片段,并将移码片段三倍重复克隆入pET-28a表达载体中。重组质粒转化E．coliBL-21后,经IPTG诱导在37℃下实现目的片段的可溶性表达。纯化表达产物,并免疫小鼠制备了多抗血清,以多抗血清为一抗,对JEv感染的Vero细胞进行免疫荧光分析,结果发现抗移码片段表达蛋白的血清可识别JEV蛋白。以JEV感染Vero细胞,提取感染细胞总蛋白,分别以NSl单抗和VAI-制备的多抗血清为一抗,进行Westernblot分析。结果显示,NS1单抗为一抗,可染出48kDa的NS1条带和56kDa的NS1′条带：而以多抗血清为一抗,仅染出56kDa的条带。上述结果显示,多抗血清识别的NS1′蛋白为NS1′移码后片段表达的蛋白。     

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因重组腺病毒的构建及表达

应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒（JEV）的NS1基因,通过Sal Ⅰ＋EcoR Ⅰ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中.重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确.将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒.PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1.     

乙型脑炎病毒NS1蛋白亚单位疫苗制备及其免疫效果评价

为制备乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)NS1蛋白亚单位疫苗并评价其免疫效果,将JEV NS1基因克隆至杆状病毒表达载体,构建重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染High5细胞,收集培养基上清,并用镍柱亲和方法纯化NS1蛋白。将纯化的NS1蛋白与弗式佐剂制成亚单位疫苗,并通过小鼠免疫接种和攻毒模型评价该疫苗的免疫效果。结果表明,50,100,200μg/只剂量的亚单位疫苗免疫组的保护率分别为70%,80%,90%;同时,较非疫苗免疫组,NS1亚单位疫苗免疫可以显著降低小鼠脑组织中的病毒载量和炎症因子的表达,减轻小鼠的神经症状和脑部病理损伤。以上结果表明NS1蛋白作为亚单位疫苗具有较好的免疫保护效果,具有开发为JEV新型疫苗的潜力。     

西尼罗病毒NS1基因的原核表达与抗原性鉴定

为进行西尼罗病毒(WNV)NY99株NS1蛋白的免疫学研究,通过PCR方法扩增WNV NY99株NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pMAL-c2X上,构建出重组表达质粒pc2X-NS1,经IPTG诱导得到可溶性的麦芽糖结合蛋白(MBP).NS1融合蛋白(MBP-NS1),其分子质量约为90 ku,约占可溶性菌体蛋白质量的50%.利用直链淀粉树脂柱对MBP-NS1纯化后的重组蛋白的纯度达到60%,westem blot和间接ELISA检测证明纯化的MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性,为进一步开展关于WNV NS1蛋白的研究奠定了基础.     

日本脑炎病毒NS1’蛋白移码片段的原核表达及免疫反应性分析

通过对日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中移码序列分析,设计合成1对引物,利用PCR扩增出NS1’移码片段,并将移码片段克隆入pET-32a表达载体中。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,经IPTG于20℃过夜诱导,实现了目的片段的可溶性表达。对表达产物进行SDS-PAGE鉴定,可检测到分子质量约为25 ku的融合蛋白。以日本脑炎病毒野毒株和弱毒株感染小鼠血清为一抗,进行Western blot分析,原核表达蛋白仅与野毒感染小鼠血清发生特异性反应,说明该蛋白具有区分临床野毒感染和疫苗免疫的潜力。     

乙型脑炎病毒NS1’蛋白编码框的扩展对病毒毒力的影响

通过分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)基因组中核糖体移码序列,在对NS2A基因实施同义突变基础上,设计2组引物,通过PCR突变方法,依次删除移码后NS1’基因开放阅读框的终止密码子,并将突变片段替换JEV感染性克隆pJEHEN中相应片段,获得了2株突变全长克隆。经体外转录合成RNA,再以RNA转染细胞,拯救出两株突变病毒vJET1和vJET2。通过RT-PCR扩增突变病毒中含突变位点的基因组片段,测序证实了vJET1基因组3690位核苷酸存在由T向A的突变,vJET2基因组3690位和3819位核苷酸均存在由T向A的突变。将vJET1和vJET2感染Vero细胞后,Western blot检测显示,两株突变病毒表达的NS1’蛋白均出现延长现象。生长曲线显示,与亲本病毒vTHen相比,突变病毒增殖速度均出现下降。动物实验显示,与vTHen相比,vJET1和vJET2对小鼠的神经毒力与神经侵袭力也出现下降。上述结果表明,NS1’编码框的延伸降低病毒在体外培养细胞上的增值速度,也减弱了病毒对小鼠的毒力。     

日本脑炎病毒NS1基因在大肠杆菌中的高效表达

提取日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的基因组RNA,用RT-PCR扩增其NS1基因cDNA,将其克隆到原核表达载体pET-30b(+)中,转化大肠杆菌BL-21(DE3),经IPTG诱导,NS1基因获得高效表达.SDS-PAGE分析显示,表达的融合蛋白表观相对分子质量约为46 000,重组NS1蛋白占菌体总蛋白的30.8%.Western blotting分析表明,重组蛋白具有良好的免疫原性.     

禽流感病毒NS2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备禽流感病毒(AIV)NS2蛋白的多克隆抗体,本研究将人工合成的NS2基因克隆至表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His-NS2重组蛋白。SDS-PAGE和western blot试验表明,该重组蛋白获得大量表达,可溶性高,并且具有较好的反应原性。将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并通过间接ELISA检测其效价达1∶20 000以上。Western blot和间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体能够与NS2蛋白特异性结合。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1-Flag蛋白在293T细胞中的表达

通过RT-PCR方法扩增出日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株的NS1基因,利用Hind Ⅲ和Hpa Ⅰ双酶切克隆到带有Flag标签的pcDNA3.1载体上,重组质粒命名为pcDNA3.1-NS1-Flag。脂质体法转染293T细胞后,经间接免疫荧光(IFA)和化学荧光Western blotting检测,证明带有Flag标签的NS1基因在293T细胞中得到高效表达。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经western blot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156.该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEV E19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应.本实验结果表明JEV E蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义.本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒（AIV）A／Goose／HLJ／p46／2003（H5N1）的NSl基因，将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上，转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析，表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示，重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后，经0．3mmol／L的IPTG诱导，融合蛋白MBP-NS1得到大量表达，融合蛋白以可溶形式存在，分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明，融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应，而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

猪日本脑炎病毒NS3蛋白的基因克隆、原核表达及纯化

提取猪日本脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,RT-PCR扩增JEV的NS3基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,酶切鉴定和PCR鉴定重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组His-JEV-NS3蛋白,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达,his-band试剂盒纯化重组蛋白。获得了1.8kb NS3基因片段,成功构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS3。IPTG诱导获得分子质量为64ku的His-JEV-NS3蛋白,该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的30%以上,纯化后获得高纯度重组蛋白,其占总蛋白比例达70%以上。