猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

绿色荧光蛋白基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株E2基因在杆状病毒中的融合表达

为了研究猪瘟病毒E2糖蛋白的立体结构及生物学特性，将增强型荧光蛋白基因（EGFP）和猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCI.V）E2基因经PCR扩增后克隆至pBlueBacHis2A质粒，与杆状病毒DNA共转染后经PCR鉴定获得了含有EGFP和HCLVE2融合基因（GFPTE2）的重组杆状病毒rBACTE2-339，并将其感染sf9细胞后在荧光显微镜下观察到了亮绿色荧光．说明融合基因已初步表达。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，均能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击。尤其是E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，同时还是研究CSFV抗原变异的主要区域。鉴于E2基因在CSFV感染、复制和免疫方面的重要作用，因此一直是猪瘟病毒研究的热点。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.     

信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽（简称endo）、蜂素信号肽（简称mel）及gp67信号肽（简称gp67）分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

化学佐剂对猪瘟病毒E2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明小白鼠为试验动物,研究了化学佐剂对猪瘟病毒Ｅ１２囊膜糖蛋白（ＨＣＶ Ｅ２）基因疫苗的免疫增强作用;用印度墨水活体染色法筛选促进印度墨水在肌肉中扩散的化学试剂,并用筛选到的化学试剂与ｐＣＤＬａｃＺ混合肌肉注射小白鼠。结果表明,斯苯和甘油能较好的促进ＬａｃＺ基因在小白胫前肌中表达,提示斯苯和甘油可作为基因疫苗的化学佐剂;用斯苯和甘油按比例混合配制ＨＣＶ Ｅ２基因疫苗质粒ｐＣＤＳＴ免疫小白鼠,其抗     

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。     

猪瘟病毒E2基因疫苗表达抗原在小白鼠胫前肌的分布及消长

用免疫组化法检测了猪瘟病毒（ＨＣＶ）Ｅ２囊膜糖蛋白基因免疫表达的抗原在小白鼠胫前肌中的分布及消长,结果：ＨＣＶ Ｅ２基因疫苗ｐＣＤＳＴ接种小白鼠胫前肌后,表达的Ｅ２抗原主要分布于肌纤维膜上,少量分布于肌纤维间,在细胞浆中很难检测到Ｅ２抗原;用ＨＣＶ基因疫苗免疫后１ｄ,Ｅ２抗原已有表达,１３ｄ抗原达高峰,以后逐渐减少,３０ｄ仪检测到少量抗原。     

猪瘟病毒E2基因密码子优化后在昆虫细胞中的表达

将猪瘟病毒E2基因密码子改造后,克隆入pFastBac1质粒载体,经转座、转染后构建重组杆状病毒.并对表达产物进行鉴定分析.结果:E2基因改造后与设计序列一致;成功获得了重组杆状病毒(BAC/SE2M),采用猪瘟E2单抗WH303进行Western-blot和ELISA鉴定,证明:表达的CSFV E2蛋白特异性好,纯化后的E2蛋白,可用于猪瘟抗体检测试剂盒的开发.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】 设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性, 为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】 利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH, 将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒, 转导HEK293T细胞, 经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞, 纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】 pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定, 得到大小分别为8 172 bp的载体片段和1 521 bp的E2-GM-CSF基因片段, 表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体; 细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1 686 bp的条带, 表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组; Western blotting分析获得约70 ku的条带, 证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达; SDS-PAGE验证显示, 纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带, 纯度较高, 大小约70 ku; 小鼠免疫血清ELISA检测结果表明, 表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性, 免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体, 免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900, 免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8 100, 远高于E2蛋白的1∶1 800。【结论】 利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白, 为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗, 同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及抗原性研究

本试验旨在分析猪瘟病毒E2蛋白的免疫反应,应用RT-PCR方法扩增了编码猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株C株囊膜糖蛋白E2基因主要编码区,并定向克隆到表达载体pET-30a-c(+)中,获得重组表达载体pET30a-E2,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blottin分析结果表明,E2基因获得高效融合表达,且具有免疫反应活性。本试验为建立E2抗原的检测试剂盒奠定基础。     

猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

咸阳地区猪瘟病毒 E2基因扩增与序列分析

为了解陕西咸阳地区猪瘟流行毒株 E2基因变异情况,采用套式 PCR 方法,扩增了17个流行毒株和2个市售疫苗毒株 E2基因主要抗原区,并进行了序列比对分析。结果表明,17个流行毒株和兔化弱毒株（HCLV）株相比,E2基因主要抗原区核苷酸同源性在79．0％～80．9％,氨基酸同源性在80．0％～84．4％。市售疫苗和 HCLV 株核苷酸同源性为93．4％,氨基酸同源性为90．0％。系统发育树分析发现17个流行毒株同属基因Ⅱ群。流行毒株与 HCLV 相应氨基酸位点相比,总体变异氨基酸位点占26．4％,呈现出典型的变异特征。17个流行毒株在2个氨基酸关键位点出现了705（T→I）、729（L→A）变异现象,可能导致抗原性发生改变。发现 E2蛋白高保守序列 RYLASLH（713～719）变异现象,即 XYSY01株719位发生了 H→R 变异。结果提示,近年陕西咸阳地区猪瘟病毒流行毒株变异较为一致,E2基因核苷酸与编码氨基酸有较明显的变异。